Thèse Relations Structure-Fonction-Activité des Protéines du Pathogène Opportuniste Nakaseomyces Glabrata Impliquées dans le Remodelage de la Paroi Cellulaire Fongique Compréhension des Facteurs d H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1 École doctorale : EDISS - Interdisciplinaire Sciences-Santé Laboratoire de recherche : MMSB - MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE ET BIOCHIMIE STRUCTURALE Direction de la thèse : Nushin AGHAJARI ORCID 0000000222452679 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-03T23:59:59 La résistance aux antifongiques a été associée, entre autres, à des changements morphologiques et à des modifications de la paroi cellulaire fongique, et donc à des altérations des réponses immunitaires de l'hôte. La paroi cellulaire du champignon se compose principalement de chitine, de chitosane et de -1,3-glucanes, entre autres polysaccharides, et son remodelage est contrôlé par des glycosides hydrolases, des glycosyltransférases et des transglycosylases. Dans ce contexte, nous étudions des protéines impliquées dans le remodelage de la paroi cellulaire de Nakaseomyces glabarata, et en particulier celles dont l'activité est liée à la chitine et aux -1,3-glucanes, dans le but de comprendre les relations entre leurs structures/fonctions/activités, et finalement leur rôle dans la pathogénicité des champignons.

Au cours du projet de thèse, l'objectif est d'étudier les enzymes de N. glabrata qui ont été présélectionnées à la suite d'études bioinformatiques préliminaires et de recherches bibliographiques, et de répondre à un certain nombre de questions essentielles et ouvertes. Afin de répondre à ces questions, la caractérisation biochimique et les études structurales de ces enzymes dans leur état natif, en complexe avec des substrats naturels (mutants), avec des inhibiteurs, des constructions tronquées (lorsque cela est utile) et avec des partenaires protéiques identifiés seront effectuées.

Le projet porte sur l'étude de huit protéines issues de la paroi fongique de N. glabarata : sept glycoside hydrolases et une synthase, afin de comprendre les relations entre leurs structures, leurs fonctions et leurs activités. L'accent sera mis sur les sept glycosidases, la synthase étant membranaire. Ainsi le projet se compose en 4 axes de recherche :

Axe 1 : Expression et purification
Au moins 4 des 7 glycoside hydrolases seront exprimés dans des systèmes procaryotes. La synthase ainsi qu'au moins un des 7 hydrolases dans des cellules de levure.
- Protocoles existants pour 2 des hydrolases ; à établir pour 3 autres
- Optimisation pour 2 des hydrolases et la synthase
- Purification par chromatographie d'affinité, échange d'ions et gel filtration
- Constructions mutantes/tronquées
Axe 2 : Identification de substrats et partenaires protéiques
- Tests de substrats naturels (chromatographie sur couche mince)
- Validation des partenaires (pull-down, co-immunoprécipitation)
Axe 3 : Caractérisations biochimiques et biophysiques
- Détermination du pH optimal, température, états oligomériques.
- Études cinétiques enzymatiques sur la base des protocoles existantes à optimiser
- Identification des interactions protéine-ligand/protéine-protéine.
Axe 4 : Analyses structurales
- Cristallographie aux rayons X pour 6 des glycosyl hydrolases
- Cristallographie aux rayons X pour les complexes inhibiteur-enzyme
- Pour une hydrolase, la synthase et complexes protéine-protéine : cryo-EM
- Pour tous, quand pertinent, diffusion de la lumière aux petits angles (SAXS)

Ressources : Toutes les compétences et équipements nécessaires sont disponibles (laboratoire, institut, plateformes).

Plus de détails seront données en contactant la directrice de thèse : ****@****.** Les infections fongiques invasives sont à l'origine d'une série de maladies graves chez l'homme et sont devenues un problème sérieux, notamment dans les unités de soins de santé. Nakaseomyces glabrata (anciennement Candida glabrata) est un pathogène opportuniste qui s'est adapté pour coloniser tous les segments du tractus gastro-intestinal. En effet, N. glabrata est le deuxième agent fongique le plus fréquemment impliqué dans les candidémies (1). Notre équipe étudie les protéines impliquées dans les mécanismes de résistance en se concentrant sur les enzymes impliquées dans les voies métaboliques, ou ayant un fort potentiel prouvé comme cible médicamenteuse dans d'autres pathogènes, comme par exemple celles impliquées dans les processus de mort programmée comme les métacaspases (2).
La résistance aux antifongiques a été associée, entre autres, à des changements morphologiques et à des modifications de la paroi cellulaire fongique, et donc à des altérations des réponses immunitaires de l'hôte (3). La paroi cellulaire du champignon se compose principalement de chitine, de chitosane et de -1,3-glucanes, entre autres polysaccharides, et son remodelage est contrôlé par des glycosides hydrolases, des glycosyltransférases et des transglycosylases (4). Dans ce contexte, nous étudions les protéines impliquées dans le remodelage de la paroi cellulaire de N. glabrata, et en particulier celles dont l'activité est liée à la chitine et aux -1,3-glucanes, dans le but de comprendre les relations entre leurs structures/fonctions/activités, et finalement leur rôle dans la pathogénicité des champignons. Ces enzymes comprennent notamment les chitine synthases, les chitinases et les -1,3-glucosidases.
Alors que des études fonctionnelles et structurales ont été réalisées pour certaines de ces enzymes chez des espèces homologues (voir par exemple 5-6), ces informations manquent pour les protéines de N. glabrata. N. glabrata étant phylogénétiquement plus proche de Saccharomyces cerevisiae que des (autres) espèces de Candida, l'acquisition de connaissances de base sur les protéines impliquées dans le métabolisme des sucres chez N. glabrata est de la plus haute importance afin de comprendre leur rôle dans le remodelage de la paroi cellulaire. Certaines de ces protéines ont été prédites d'avoir des partenaires protéiques (7) qui, cependant, au stade actuel, n'ont pas été prouvés expérimentalement pour les protéines de N. glabrata. L'étude de l'ensemble de ces protéines devrait fournir une base essentielle pour la compréhension du fonctionnement de ces protéines. Les protéines dont l'activité est liée à la chitine et aux -1,3-glucanes comprennent entre autres les chitines synthases, les chitinases et les -1,3-glucosidases. Au cours du projet de thèse, l'objectif est d'étudier les enzymes de N. glabrata qui ont été présélectionnées à la suite d'études bioinformatiques préliminaires et de recherches bibliographiques, et de répondre à un certain nombre de questions essentielles et ouvertes. Afin de répondre à ces questions, la caractérisation biochimique et les études structurales de ces enzymes dans leur état natif, en complexe avec des substrats naturels (mutants), avec des inhibiteurs, des constructions tronquées (lorsque cela est utile) et avec des partenaires protéiques identifiés seront effectuées. Méthodes d'expression des protéines et caractérisation biochimiques et biophysiques standard, tests d'activité enzymatiques, études structurales (cristallographie aux rayons X, cryo-EM, diffusion de la lumière aux petits angles...).