Thèse Optimisation de l'Édition du Génome chez les Agrumes Étude Fonctionnelle de Caractères d'Intérêt Agronomique H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Montpellier
École doctorale : GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau
Laboratoire de recherche : AGAP Institut, Amélioration Génétique et Adaptation des Plantes
Direction de la thèse : Fabienne MICHELI ORCID 000000029031362X
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-07T23:59:59

Les agrumes sont cultivés dans plusieurs pays aux climats tropicaux et subtropicaux, où ils font face à des défis sérieux tels que le manque d'eau, l'incidence de pathogènes et la demande croissante de produits agricoles à haute valeur nutritionnelle. Pour éviter l'impact de ces stress et améliorer la qualité des fruits, les systèmes agricoles modernes utilisent des stratégies qui entraînent une forte érosion de la diversité génétique et une dégradation rapide de la santé des écosystèmes. Il est donc impératif de repenser l'agriculture et les méthodes d'amélioration, en tenant compte du développement rapide de nouvelles technologies telles que l'édition du génome (e.g. CRISPR-Cas9). Ainsi, l'édition du génome offre de nouvelles possibilités pour surmonter les limitations de l'amélioration conventionnelle en générant de nouveaux allèles pour le gène cible directement dans des variétés élites, raccourcissant la durée de la sélection et évitant les générations de rétrocroisements classiquement réalisées. L'édition du génome est associée à la transformation génétique et à la culture de tissus, qui, en fonction de la plante utilisée, peuvent présenter des obstacles techniques, les méthodes choisies dépendant de divers facteurs tels que le type d'explant ou les génotypes d'agrumes utilisés. Par conséquent, l'objectif général du projet de thèse sera de participer à la mise en place d'un protocole d'édition du génome chez les agrumes, et de faire une preuve de concept, à partir de quelques gènes (de 1 à 3) présélectionnés (associés à la susceptibilité/résistance à l'alternariose, à la tolérance au stress hydrique, et/ou à la qualité du fruit), de l'utilisation de cette technique pour des études fonctionnelles en amont de l'amélioration variétale chez les agrumes.

Les agrumes sont cultivés dans plusieurs pays tropicaux et subtropicaux, avec une production mondiale de plus de 124 millions de tonnes, à l'origine d'un marché qui dépasse les 22 milliards de dollars par an [1, 2]. Dans les pays méditerranéens et tropicaux, les zones productrices d'agrumes sont confrontées à de sérieux défis : i) la rareté des ressources naturelles, telles que l'indisponibilité en eau douce et l'incidence des conditions environnementales défavorables associées au changement climatique ; ii) l'incidence des agents pathogènes qui causent des pertes économiques de plusieurs millions de dollars ; iii) la demande croissante de produits agricoles innovants à plus forte valeur nutritionnelle.
L'exécution de programmes d'amélioration conventionnels d'agrumes - qui nécessitent l'introgression ou la pyramidation de gènes par rétrocroisements - est entravée par des facteurs génétiques et reproductifs, qui font que le temps d'obtention de nouvelles variétés est un facteur limitant. Dans ce contexte, avoir identifié des gènes clés impliqués dans des processus d'intérêt et avoir validé leurs fonctions in vitro est un prérequis pour ensuite les associer à des programmes d'amélioration. Pour cela, la validation fonctionnelle des gènes par génie génétique est une étape nécessaire qui a, au fil des années, été facilitée par le développement de techniques biotechnologiques telles que l'édition du génome, la culture in vitro et la transformation génétique [3]. De plus, ces approches peuvent être utilisées pour créer, dans un court laps de temps, de nouvelles variétés de plantes cultivées qui répondent à la fois à la demande du producteur et du consommateur, offrant de nouvelles alternatives pour l'amélioration de cet important groupe d'espèces [4, 5].
L'édition du génome est l'une des approches biotechnologiques les plus récentes, réalisée via la technique CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) - associated (Cas) [3, 5]. Cette technique consiste à cliver l'ADN génomique au niveau de séquences prédéterminées à l'aide d'un ARN guide, visant l'inactivation de fonction, la délétion de tout ou partie d'un gène, voire l'insertion de séquences, et a été utilisée chez divers organismes, dont les plantes [6, 7]. La manipulation précise et spécifique du génome, ainsi que la facilité d'utilisation de cette technique, ont permis au CRISPR/Cas de gagner en importance dans les études fonctionnelle de gènes et de sélection végétale [8-11].
L'édition du génome est associée à la transformation génétique et à la culture in vitro qui, selon la plante utilisée, peuvent présenter des limitations techniques. Chez les agrumes, les stratégies de transformation génétique les plus utilisées sont l'utilisation d'Agrobacterium tumefaciens, le bombardement de particules et le polyéthylène glycol ou l'électroporation [12]. La méthode choisie dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels le type d'explant, qui dans le cas des agrumes, sont généralement des segments d'épicotyle, des cals embryogènes et des protoplastes ; ces derniers étant plus adaptés au CRISPR/Cas car limitant la production de plantes chimériques après régénération [12]. Pour la régénération de plantes entières, l'embryogenèse somatique est couramment utilisée chez les agrumes [13, 14]. Cette méthode consiste à cultiver des protoplastes en milieu liquide, favorisant leur multiplication et permettant l'émergence d'embryons sans fécondation, directement s'ils proviennent de tissus végétatifs, ou indirectement en cas d'utilisation de cals [15]. L'utilisation de protoplastes est donc considérée comme la méthode préférentiellement associée à l'édition du génome à la fois pour l'expression transitoire, mais aussi parce que chez les agrumes, les 'protoplastes édités' peuvent être utilisés pour régénérer des plantes entières [16].
L'édition du génome ne peut être réalisée sans une bonne caractérisation du ou des gènes qui contrôlent la caractéristique d'intérêt, et l'accès à la séquence du génome de l'espèce. Récemment, une grande quantité de génomes d'agrumes a été séquencée et est disponible dans les bases de données publiques [17-21] ou au sein de l'UMR AGAP Institut. D'autre part, plusieurs études antérieures ont permis d'identifier des gènes cibles, bons candidats pour l'édition du génome et associés à des caractéristiques d'intérêt pour l'amélioration variétale :
(i)Parmi les pathogènes affectant la citriculture, on trouve le champignon Alternaria alternata, agent causal de la tache brune d'Alternaria. Les bases génétiques de la résistance et de la susceptibilité à A. alternata ont déjà été analysées, et il a été démontré que la résistance à la maladie est contrôlée par un seul allèle récessif, étant donné que les plantes susceptibles présentent des allèles hétérozygotes ou hétérozygotes dominants [22]. La cartographie fine d'un locus de résistance à la tache brune d'Alternaria dans le génome de Citrus clementina a permis d'identifier 24 gènes potentiellement associés à la résistance [23], et donc bons candidats pour une analyse fonctionnelle du déterminisme de la résistance des agrumes à cette maladie via transformation génétique et édition du génome par knockout. Deux de ces gènes ont été présélectionnés et clonés dans des vecteurs CRISPR/Cas et sont disponibles au laboratoire ;
(ii)Au cours des dernières décennies, la pénurie d'eau a été la principale menace pour la production agricole dans le monde, se reflétant directement par une baisse de productivité et de qualité - notamment des fruits chez les agrumes. La recherche de gènes candidats conférant une tolérance au déficit hydrique chez les agrumes revêt donc une importance capitale. Récemment, une analyse par ARN-Seq d'agrumes soumis à un déficit hydrique a permis d'identifier deux facteurs de transcription, CsMYB64 et CsWRKY15, régulés négativement chez les plantes stressées dès les premiers stades de la déshydratation [24]. Par conséquent, l'édition de ces gènes par knockout peut également être envisagée ; des spacers ont été dessinés pour ces gènes et sont disponibles pour les prochaines étapes de clonage ;
(iii)Parmi les critères de qualité des fruits d'agrumes, on trouve la couleur de la pulpe et de la peau, due à la teneur en caroténoïdes dont la voie de biosynthèse implique plusieurs gènes (e.g. phytoène desaturase/PDS et la bêta-carotène hydroxylase/Hy-b). Dans des travaux antérieurs, il a été montré que certains de ces gènes sont des marqueurs de la diversité interspécifique et intraspécifique entre les mandarines et les pamplemousses [25], et que les formes haplotypiques de certains d'entre eux pourraient être responsables des différences de couleur observées entre les deux espèces. Ces gènes et les formes haplotypiques correspondantes sont donc également de bons candidats pour une analyse via CRISPR/Cas (knockout ou base editing). Des spacers ont été dessinés pour le gène PDS et sont disponibles pour les prochaines étapes de clonage.

En raison de leur mode de vie, les plantes sont constamment exposées à des stress biotiques et abiotiques qui peuvent avoir des effets dévastateurs sur le rendement et la qualité de la production agricole, y compris chez les agrumes. Dans un contexte de changement environnemental toujours plus rapide et extrême (e.g. températures élevées, sécheresse, apparition de nouveaux phytopathogènes et ravageurs), l'adaptation des plantes à ces stress peut-elle être avantagée, voire accélérée, par l'utilisation des nouvelles techniques génomiques (NGT) ? L'objectif général du projet de thèse sera de participer à la mise en place d'un protocole d'édition du génome chez les agrumes et de faire une preuve de concept, à partir de quelques gènes (de 1 à 3) présélectionnés (associés à la susceptibilité/résistance à l'alternariose, à la tolérance au stress hydrique, et/ou à la qualité du fruit), et de l'utilisation de cette technique pour des études fonctionnelles en amont de l'amélioration variétale chez les agrumes. Une des hypothèses qui sera testée est que l'édition d'un des gènes cibles permet une altération de l'expression, du métabolisme et/ou du phénotype correspondant, de façon transitoire ou stable, avec comme conséquence potentielle un avantage adaptatif pour la plante.

1. Choix des gènes et obtention des constructions gRNA/CRISPR-Cas9
Les gènes d'intérêt (GeneI) associés à la résistance à A. alternata (e.g. disease resistance protein), à la tolérance au déficit hydrique (e.g. CsMYB64 et CsWRKY15) ou à la qualité des agrumes (e.g. PDS, Hy-b) ont été préalablement sélectionnés et pourront être utilisés pour la mise au point du protocole d'édition et de transformation des agrumes. Une préférence sera donnée aux gènes CsMYB64, CsWRKY15 et PDS pour des questions de facilité d'analyse du phénotype après transformation/édition (voir -3 ci-dessous). Les stratégies de clonage ont été élaborées et les constructions CRISPR/Cas sont en cours d'obtention ; le (la) candidat(e) prendra la suite des expériences en cours. Brièvement, les séquences de travail seront obtenues à partir de données de séquençage préalables des espèces à éditer [17-21, 26], et la sélection des spacers sera effectuée à l'aide de CRISPOR [27]. Ce programme permet la sélection de la région génomique d'intérêt pour le knockout de la fonction (région on-target), entre autres, en prenant en compte la quantité et la localisation des éventuels sites de mutation hors cible (off-target), et les limitant. Le clonage des séquences d'intérêt sera réalisé dans le vecteur pEn-Chimera, et la construction obtenue sera recombinée avec le vecteur pDE_Cas9 en utilisant la LR clonase (système Gateway) [28], selon la méthodologie établie sur la plateforme Analyse Fonctionnelle et Édition du Génome (AFEG) du CIRAD [29, 30]. Les résultats des différentes étapes de clonage seront validés par digestion et séquençage en utilisant des enzymes et des amorces adaptées [30].

2. Transformation des plantes et validation de l'édition
Les vecteurs recombinants pDE_Cas9::GeneI seront utilisés pour la transformation de différents types d'explants (e.g. protoplastes, épicotyles, cals) par électroporation ou par Agrobacterium tumefaciens en adaptant des protocoles préalablement décrits et utilisés dans les laboratoires de l'UESC et de l'Embrapa [31-34]. Les génotypes d'agrumes seront choisis en fonction du GeneI ainsi que de la stratégie de design des spacers (e.g. spécifique d'un génome ou dans une région commune à plusieurs génomes) ; par exemple, le génotype Star Ruby (C. paradisi) sera utilisé pour l'étude du gènes PDS (les spacers seront dessinés à partir des séquences génomiques parentales C. sinensis et C. maxima). L'optimisation du pipeline de transformation/régénération sera effectuée en fonction des espèces d'agrumes transformées, de la méthode de transformation, des explants utilisés, et/ou des conditions de culture in vitro et de régénération. Une attention particulière sera portée au type de transformation obtenue (transitoire vs stable) pour les étapes subséquentes. Après les étapes de transformation et de régénération, la vérification de l'édition du génome des explants transformés sera réalisée par le test 'surveyor assay', par une digestion enzymatique en 'T7E1', par High Resolution Melt (HRM) et/ou par séquençage [35, 36]. Les méthodes seront discutées avec les chercheurs participant aux différents projets appuyant la thèse et pourront évoluer en fonction des avancées obtenues par ailleurs (e.g. projet PEPR SVA, voir également -Conditions scientifiques matérielles).

3. Tests fonctionnels sur explants ou plantules transformées
Des tests physiologiques simples et une analyse du phénotype des régénérants après édition seront effectués en fonction du gène étudié. La priorité sera donnée aux gènes associés à la tolérance au stress hydrique et à la couleur du fruit pour permettre une analyse phénotypique rapide. En effet, des tests de déshydratation sur cals transformés peuvent être mis en place par utilisation de PEG (PEG-mimic drought) or NaCl (stress salin) [37], alors que le knockout du gène PDS prévoit un phénotype albinos [38, 39].