Thèse Caractérisation de l'Interaction Physique et Fonctionnelle Entre le Facteur de Transcription Foxl2 et les Protéines Chromatiniennes Trim28 et Hp1 dans la Régulation de l'Homéostasie de l'Ova H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Au cours de la reproduction féminine, l'ovocyte est entouré de cellules de la granulosa qui prolifèrent pour former le follicule mature. Une prolifération et une différenciation aberrantes de ces cellules conduisent à des tumeurs des cellules de la granulosa de l'ovaire (GCT), qui représentent 5 % de cancers de l'ovaire. Au niveau moléculaire, la plupart, sinon la totalité, des GCT portent la même mutation (c.402C>G ; p.C134W) dans le gène foxl2 (Shah et al., 2009). FOXL2 est un facteur de transcription essentiel pour le développement normal de l'ovaire (Georges et al, 2014). Des études in vitro récentes suggèrent que la mutation FOXL2 C134W altère à la fois la spécificité de liaison à l'ADN ainsi que la capacité d'interaction de FOXL2 avec ses partenaires induisant un redéploiement génomique partiel de la protéine mutée (Leung et al, 2016 ; Carles et al, 2020). Parmi ses partenaires, TRIM28 est un cofacteur transcriptionnel dont la fonction la mieux caractérisée est l'extinction des éléments transposables (Randolf et al., 2022). Nous avons montré que la perte de TRIM28 dans les cellules de la granulosa (Trim28cKO) conduit à la transdifférenciation de ces cellules en cellules de Sertoli, phénocopiant le phénotype induit par la délétion de FOXL2 dans ces mêmes cellules (Foxl2cKO), démontrant ainsi que les deux protéines sont essentielles pour le maintien de l'identité des cellules de la granulosa (Uhlenhaut et, 2009 ; Rossito et al, 2022). De plus, plus de 50% des gènes dérégulés par la mutation FOXL2C134W dans le GCT humain sont également dérégulés dans le modèle de souris Trim28cKO (Rossito et al, 2022 ; Herman et al, 2024). En plus de FOXL2, TRIM28 interagit fonctionnellement avec les protéines HP1 (Heterochromatin Protein 1) (Riclet et al, 2009 ; Herzog et al, 2011). Les HP1 sont caractérisées par leur organisation structurale, avec un domaine Chromodomain (CD) N-terminal permettant l'association de ces protéines à la marque répressive H3K9me3 et un domaine ChromoShadow (CSD) C-terminal impliqué dans l'interaction avec de multiples protéines, y compris TRIM28 (Canzio et al, 2014). Chez les mammifères, il existe trois isotypes HP1, HP1, et , dont les fonctions individuelles sont encore mal caractérisées.
De façon intéressante, la mutation d'un allèle du gène trim28 bloquant l'interaction entre TRIM28 et HP1 (trim28HP1box), induit une désorganisation drastique de l'ovaire sans transdifférenciation, contrairement à ce que nous avions précédemment observé suite à la perte de TRIM28, suggérant fortement que TRIM28 a des fonctions dépendantes et indépendantes de son interaction avec HP1 importantes pour l'homéostasie de l'ovaire. Pour continuer la caractérisation des mécanismes moléculaires sous-jacents les fonctions des complexes FOXL2/TRIM28/HP1, nous avons initié la délétion de HP1, HP1 et/ou HP1 spécifiquement dans les cellules de la granulosa. Nos résultats préliminaires indiquent que, comme FOXL2 et TRIM28, les HP1 sont essentielles au maintien de l'identité des gonades.
Dans ce projet, nous proposons de caractériser les interactions entre FOXL2, TRIM28 et HP1 et d'étudier les fonctions des complexes FOXL2/TRIM28/HP1 dans l'ovaire. Le projet sera subdivisé en trois objectifs principaux : 1) caractériser les phénotypes ovariens des souris trim28HP1box et hp1cKO en relation avec ceux des souris foxl2C134W et trim28cKO et 2) caractériser l'influence de la mutation TRIM28HP1box et/ou de la perte des HP1 sur la spécificité de liaison de FOXL2 et TRIM28 à leurs cibles génomiques et 3) évaluer l'impact de ces mutations sur le paysage chromatinien de ces cibles, leur organisation sub-nucléaire et l'expression des gènes associés.

Chez les Vertébrés, l'unité fonctionnelle de l'ovaire assurant la production des gamètes féminins est le follicule ovarien, une petite structure sphérique constituée d'un ovocyte entouré de cellules spécialisées, les cellules de la granulosa et les cellules thécales, qui soutiennent sa croissance, sa maturation et la synthèse d'hormones (notamment les estrogènes). La maturation folliculaire correspond au processus par lequel le follicule croît et se prépare à l'ovulation, sous l'impulsion de la prolifération des cellules de la granulosa. Lorsque la prolifération et la différenciation de ces cellules sont altérées des tumeurs des cellules de la granulosa de l'ovaire (GCT) se développent. Ces cellules représentent 5 % de cancers de l'ovaire dont 95 % ne se déclarent que chez l'adulte (AGCT). L'évolution clinique des GCT est caractérisée par une croissance indolente avec une récidive tardive mais fatale pour 80 % des patients (Jamieson et Fuller, 2012). Au niveau moléculaire, la plupart, sinon la totalité, des AGCT portent la même mutation (c.402C>G ; p.C134W) dans le gène Foxl2 (Shah et al., 2009). FOXL2 est un facteur de transcription membre de la famille des Forkhead Box (FOX) essentiel pour le développement normal de l'ovaire (Georges et al., 2014). Des études in vitro récentes suggèrent que la mutation FOXL2 C134W altère à la fois la spécificité de liaison à l'ADN ainsi que la capacité d'interaction de FOXL2 avec ses partenaires induisant un redéploiement génomique partiel de la protéine mutée (Carles et al., 2020). Ainsi, l'immunoprécipitation de la chromatine suivie d'un séquençage profond (ChIP-seq) de FOXL2 WT et C134W dans des cellules de granulosa a montré que FOXL2C134W se lie à la majorité des éléments reconnus par FOXL2WT mais également à plus de 60,000 nouvelles régions dans le génome (Carles et al., 2020).
FOXL2 interagit avec un grand nombre de protéines, parmi lesquelles TRIM28 (Migale et al., 2024; Penrad-Mobayed et al., 2020; Rossitto et al., 2022). TRIM28 est une protéine architecturale de la chromatine, capable de moduler l'expression génique en agissant à la fois comme activateur et répresseur transcriptionnel, notamment via le contrôle des éléments transposables. (Randolph et al., 2022). Nous avons montré que la perte spécifique de TRIM28 dans les cellules de la granulosa (Trim28cKO) conduit à la transdifférenciation de ces cellules en cellules de Sertoli, phénocopiant le phénotype induit par la délétion de FOXL2 dans ces mêmes cellules (Foxl2cKO), démontrant ainsi que les deux protéines sont des régulateurs essentiels du maintien du destin des cellules de la granulosa (Rossitto et al., 2022; Uhlenhaut et al., 2009). De plus, plus de 50% des gènes dérégulés par la mutation FOXL2C134W dans l'AGCT humain sont également dérégulés dans le modèle de souris Trim28cKO (Herman et al., 2024; Rossitto et al., 2022). En accord avec ces derniers résultats, FOXL2 et TRIM28 partagent un grand nombre de sites de liaison génomiques (environ 50%), suggérant que FOXL2 et TRIM28 interagissent non seulement physiquement mais aussi fonctionnellement pour établir et maintenir les programmes transcriptionnels essentiels à l'identité des gonades. En plus de son interaction avec FOXL2, TRIM28 interagit avec les protéines associées à la chromatine HP1 (Heterochromatin Protein 1) et nous avons précédemment montré que cette interaction est essentielle pour certaines mais pas la totalité des fonctions de TRIM28 (Herzog et al., 2011; Riclet et al., 2009). Les protéines HP1, initialement identifiées comme le principal composant de l'hétérochromatine, sont hautement conservées tout au long de l'évolution, des levures aux mammifères, et sont impliquées dans tous les processus nucléaires faisant intervenir la chromatine. Ces fonctions pléiotropiques des HP1 reposent sur leur organisation structurale, avec un domaine Chromodomain (CD) N-terminal permettant l'association de ces protéines à la chromatine via la reconnaissance de la marque répressive H3K9me3 et un domaine ChromoShadow (CSD) C-terminal impliqué dans la dimérisation des HP1, une plateforme permettant le recrutement de multiples protéines à la chromatine, y compris TRIM28 (Canzio et al., 2014). Chez les mammifères, il existe trois isotypes HP1, HP1, et , dont les fonctions individuelles sont encore mal caractérisées. Bien que plusieurs études plaident pour un rôle dans le cancer, notre étude récente a été la première démonstration in vivo que, dans le foie de souris, les protéines HP1, très probablement via leur interaction avec TRIM28, sont un frein essentiel au développement tumoral via la répression d'éléments transposables (Calvet et al., 2022; Saksouk et al., 2020).
Dans l'ovaire de la souris, la mutation d'un allèle du gène Trim28 bloquant l'interaction entre TRIM28 et HP1 (Trim28 HP1box/+), induit une désorganisation drastique de l'ovaire avec une fragmentation des follicules. Trim28HP1box se comporte comme une protéine à effet dominant négatif, tout comme la protéine mutante FOXL2C134W (données non publiées et Llano et al, 2023). L'inactivation conditionnelle du deuxième allèle Trim28 (Trim28HP1box/cKo) entraîne une aggravation modérée du phénotype mais pas de transdifférenciation, comme nous l'avions précédemment observé lors de l'inactivation conditionnelle des deux allèles de Trim28 (Trim28cKo/cKo), suggérant que TRIM28 a des fonctions dépendantes et indépendantes de son interaction avec HP1 importantes pour l'homéostasie de l'ovaire. Enfin, l'augmentation de prolifération des cellules de la granulosa ainsi que du poids des ovaires mutants Trim28 HP1box/+ suggèrent fortement que ces souris développent des AGCT (données non publiées).
Enfin, nous avons initié la délétion de HP1 et HP1 spécifiquement dans les cellules de la granulosa (Hp1cKO) en utilisant la recombinase Cre exprimée sous le contrôle du promoteur Nr5a1 (Bingham et al., 2006). Nos résultats préliminaires indiquent que la perte simultanée de HP1 et HP1 dans les cellules de la granulosa conduit à un développement ovarien anormal, caractérisé par une expansion aberrante des follicules primaires chez les jeunes souris. Ces résultats montrent que les HP1 dans les cellules de la granulosa sont essentielles au développement normal de l'ovaire et suggèrent que, comme dans le foie, les HP1 pourraient jouer un rôle critique dans la prévention de la tumorigenèse ovarienne. D'autres combinaisons d'inactivation des HP1 sont en cours d'analyse.
Ainsi, la littérature et l'ensemble de nos données préliminaires suggèrent fortement que le complexe FOXL2/TRIM28/HP1 forme un complexe multi-protéique essentiel pour l'homéostasie de l'ovaire. Nous faisons l'hypothèse que les mutations FOXL2C134W et TRIM28HP1box compromettent la stabilité et/ou la conformation de ce complexe. De plus, étant donné que l'une des fonctions les mieux établies de TRIM28 est de réprimer les éléments transposables, dont la ré-expression pourrait perturber l'activité de nombreux gènes, nous proposons que l'altération du complexe FOXL2/TRIM28/HP1 modifierait le recrutement et l'activité de TRIM28 et de FOXL2 sur leurs cibles génomiques, entraînant une perturbation du programme d'expression génique de la granulosa - soit directement, soit via la ré-activation d'éléments transposables - et favorisant ainsi le développement de tumeurs ovariennes.

Les objectifs principaux de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes épigénétiques qui permettent le choix de programmes d'expression géniques adaptés à un destin cellulaire donné. En particulier, nous proposons de comprendre comment le facteur de transcription FOXL2, le cofacteur transcriptionnel TRIM28 et les protéines chromatiniennes HP1 interagissent et comment ce complexe cible et modifie certains loci génomiques spécifiques.

1- Caractérisation de la cinétique des phénotypes dans les ovaires de souris mutants
Pour déterminer les temps cruciaux potentiellement régulés par le complexe FOXL2/TRIM28/HP1, l'analyse macroscopique et histologique de l'ontogenèse (de 0 à 18 mois) des phénotypes des mutants trim28HP1box/- et hp1cKO sera réalisée et comparée aux phénotypes publiés des souris mutantes foxl2C134W et trim28cKO. Dans le cas des hp1cKO, l'analyse des animaux portant différentes combinaisons d'inactivation d'HP1, HP1 et/ou HP1 KO sera effectuée pour identifier le ou les isotype(s) d'HP1 important(s) pour l'homéostasie de l'ovaire. Comme indiqué précédemment, nous avons déjà des données préliminaires qui indiquent que la perte simultanée d'HP1 et HP1 (HP1cKO) ou HP1 et HP1 (HP1cKO) induisent des altérations de l'organisation de l'ovaire. L'impact de la perte ou de la mutation de ces protéines sur l'organisation fonctionnelle de l'ovaire sera complété par des analyses d'immunofluorescence (IF) avec des marqueurs fonctionnels connus de la granulosa (FOXL2, GATA4, Aromatase, AMH). Si l'analyse histologique suggère une transdifférenciation des cellules de granulosa en cellules de Sertoli, comme cela a été observé dans les mutants trim28cKO, nous mesurerons l'expression de marqueurs des cellules de Sertoli (SOX9, DMRT1 et SOX8) par IF. De plus, si l'analyse histologique suggère une altération de l'identité des cellules de la granulosa et/ou leur hyper-prolifération, nous envisagerons (i) l'IF ou l'ImmunoHistoChimie (IHC) avec des anticorps dirigés contre les marqueurs de prolifération (Phospho-Histone H3 ou Ki67) et (ii) de mesurer l'expression des gènes codant pour les facteurs connus pour être impliqués dans le développement des TCG telles que les molécules de signalisation de la voie WNT canonique ou les gènes cibles directs de p53 tels que les facteurs pro-apoptotiques Bax (Bcl-2-associated X) et Bak (Bcl-2 homologous antagonist killer) par RT-qPCR quantitative. Enfin, des défauts potentiels d'apoptose seront analysés en utilisant la technologie TUNEL (Terminal desoxynucléotidyl transferase dUTP Nick End Labeling).
Cette première partie du projet nous permettra d'identifier les fonctions spécifiques et redondantes des différents isotypes d'HP1 et en particulier, les fonctions de leur interaction avec TRIM28 dans les cellules de la granulosa et de déterminer si ces fonctions sont potentiellement liées à leur interaction avec FOXL2.
2- Analyse du transcriptome pendant la progression du phénotype
Nos analyses du point (1) nous permettront de déterminer les points temporels cruciaux à explorer plus en détail au niveau transcriptomique dans les ovaires mutants. Au laboratoire, nous avons déjà testé l'analyse de transcriptomes à partir d'ovaires entiers versus cellules de granulosa purifiées et n'avons pas observé de différence significative. Par conséquent, les ARN totaux d'ovaires entiers d'animaux trim28HP1box/- et les hp1cKO sélectionnés au point (1) aux temps les plus pertinents seront traités pour des expériences de RNAseq via la plateforme de séquençage MGX de Montpellier. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus à partir des souris WT, trim28cKO et foxl2C134W. Les résultats transcriptomiques seront également comparés à ceux obtenus à partir d'AGCT humains en utilisant des stratégies bioinformatiques appropriées pour déterminer leur degré de similitude (chevauchement et voies communes altérées). Comme indiqué précédemment, une des fonctions les mieux caractérisées de TRIM28 est sa participation dans l'extinction des éléments transposables. Par conséquent, l'analyse du transcriptome sera étendue aux éléments répétés. Cette analyse bioinformatique nécessite une expertise spécifique que nous avons au laboratoire.
3- Identification et caractérisation des cibles génomiques de FOXL2/TRIM28/HP1
Il a été montré que FOXL2 et TRIM28 partagent un grand nombre de cibles génomiques dans les ovaires normaux (Rossito et al, 2022). De plus des expériences de ChIP-SICAP (chromatin immunoprecipitation with selective isolation of chromatin-associated proteins) et de protéomique, ont montré que les deux protéines ainsi que les HP1, sont engagées dans des complexes protéiques communs associés à la chromatine (Penrad-Mobayed et al, 2020 ; Migale et al, 2024). Par conséquent, afin de déterminer l'influence de chacun des partenaires du complexe FOXL2/TRIM28/HP1 sur la spécificité de fixation des autres facteurs du complexe, le profilage génomique de FOXL2, TRIM28 et des isotypes de HP1 les plus pertinents sera réalisé dans les ovaires trim28HP1box/- et hp1cKO par des approches quantitatives de ChIP-seq. Ces données seront comparées aux données disponibles de ChIP-seq de FOXL2, FOXL2C134W et TRIM28 réalisées dans des ovaires WT et mutants foxl2C134W et trim28cKO (Rossito et al, 2022).
L'analyse sera complétée par ChIP-seq des marques d'histones caractéristiques des enhancers (H3K4me1 ou H3K27ac), de la transcription réprimée (H3K27me3) et de l'hétérochromatine (H3K9me3). Cette dernière marque est d'une importance particulière dans notre projet puisque de nombreuses études, notamment dans la levure, ont montré que les HP1 sont essentielles dans l'établissement, le maintien et l'interprétation de la déposition de cette marque et que l'altération de cette marque s'avère avoir des conséquences négatives sur le développement de cancer (Oleksiewicz et al., 2024). De plus, nous disposons de données indiquant un dimorphisme sexuel drastique, avec une perte globale de H3K9me3 dans la granulosa par rapport aux cellules de Sertoli (données non publiées). Le profilage génomique sera combiné aux données RNAseq du point (2) pour déterminer s'il existe une corrélation entre le(s) défaut(s) chromatiniens et l'expression anormale des gènes associés suite aux mutations de FOXL2, TRIM28 et/ou HP1 dans les cellules de la granulosa. Il est probable que cette analyse conduise à l'identification d'enhancers régulés par FOXL2/TRIM28. Pour une sélection de gènes dérégulés dans les différents mutants basée sur une fonction potentiellement importante pour l'homéostasie de la granulosa, nous analyserons l'association entre les enhancers associés à FOXL2/TRIM28 et le promoteur du gène correspondant dans les différentes souris mutantes. À cette fin, nous utiliserons la technologie de capture de conformation de la chromatine (3C) que nous avons déjà utilisée avec succès pour l'identification d'enhancer du gène trim24 régulé par HP1 (Calvet et al, 2022). Cette analyse sera réalisée dans les différents contextes génétiques pour identifier les facteurs critiques impliqués dans ces interactions. Enfin, nous mettrons en parallèle les résultats des parties 2 et 3 et tenterons de déterminer en quoi ces résultats peuvent expliquer les phénotypes observés dans la partie 1.