Thèse Sondes Chimiques pour Révéler et Caractériser les Fonctions Alternatives des Protéines H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Santé et médicaments École doctorale : Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué Laboratoire de recherche : Médicaments et Technologies pour la Santé Direction de la thèse : Mireille MOUTIEZ ORCID 0000000200648291 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-07-30T23:59:59 Certaines protéines, appelées protéines « moonlighting », peuvent exercer différentes fonctions selon leur localisation au sein de la cellule. La macrophage élastase, ou MMP-12, constitue un exemple particulièrement intéressant de ce phénomène.
La MMP-12 est une protéase composée de trois domaines distincts : un prodomaine (Pro), qui occupe le site actif et empêche l'activité enzymatique ; un domaine catalytique (Cat), responsable de l'activité protéolytique ; et un domaine hémopexine (Hem), impliqué dans la reconnaissance de certains substrats endogènes. La MMP-12 est initialement sécrétée à l'extérieur de la cellule sous une forme inactive (zymogène) contenant ces trois domaines.
Après élimination du prodomaine, la MMP-12 devient active et peut dégrader différents composants de la matrice extracellulaire, mais également certaines chimiokines et cytokines. De manière remarquable, cette protéase peut aussi subir une autolyse, conduisant à la séparation du domaine catalytique et du domaine hémopexine. Ces deux fragments présentent alors des localisations cellulaires et des fonctions biologiques distinctes.
Ainsi, le domaine hémopexine peut rester à l'extérieur de la cellule et exercer une activité antibactérienne (Houghton et al., Nature, 2009), tandis que le domaine catalytique peut être internalisé, migrer jusqu'au noyau et agir comme facteur de transcription (Marchant et al., Nature Medicine, 2014).
Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse est de développer une nouvelle génération d'outils moléculaires capables de reconnaître sélectivement les différentes formes de la MMP-12. Ces outils permettront de mieux caractériser leur localisation cellulaire et, par conséquent, leurs fonctions biologiques respectives.
Protéines « moonlighting », pouvent exercer différentes fonctions selon leur localisation au sein de la cellule. Focus sur la macrophage élastase MMP12. L'objectif de cette thèse est de développer une nouvelle génération d'outils moléculaires capables de reconnaître sélectivement les différentes formes de la MMP-12. Ces outils permettront de mieux caractériser leur localisation cellulaire et, par conséquent, leurs fonctions biologiques respectives.
Deux types d'outils seront développés :
- des sondes d'activité pseudo-peptidiques, destinées à détecter préférentiellement les formes contenant le domaine catalytique (Cat seul ou Cat-Hem) ;
- des aptamères, capables de reconnaître l'ensemble des formes de la MMP-12, y compris la forme zymogène complète (Pro-Cat-Hem) ainsi que le domaine hémopexine isolé.
Les approches développées dans cette thèse pourront ensuite être étendues à d'autres MMPs présentant des activités « moonlighting » (Jobin et al., Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research, 2017), voire à d'autres familles de protéines. Plus largement, le développement d'outils permettant d'étudier les fonctions multiples des protéines représente une étape importante pour mieux comprendre leur rôle dans les processus physiologiques et pathologiques, et pourrait à terme contribuer à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Le projet s'articulera autour de trois axes de recherche complémentaires.

Axe 1 : Design, synthèse et caractérisation d'une nouvelle génération de sondes d'affinité ciblant les formes actives de la MMP-12
Cet axe vise à développer une nouvelle génération de sondes capables de transférer sélectivement une étiquette analytique aux formes actives de la MMP-12 (Cat et Cat-Hem). Le design de ces sondes, appelées affinity-based probes (AfBPs), s'inspirera de ceux récemment développés par notre équipe (Kaminska et al., Angewandte Chemie International Edition, 2021 ; Malgorn et al., Methods in Molecular Biology, 2024 ; Devel et al., ChemBioChem, 2024 ; Berthy et al., Angewandte Chemie International Edition, 2024).
Ces AfBPs seront constituées de trois éléments :
un motif de reconnaissance interagissant spécifiquement avec le domaine catalytique de la MMP-12 ;
un lien électrophile clivable susceptible de réagir, par effet de proximité, avec un nucléophile situé à la surface de la protéase ;
une étiquette analytique.
Dans le cadre de ce projet, l'étiquette analytique sera un groupement prosthétique permettant la dérivation de la protéase marquée par une réaction de chimie click. Les marqueurs introduits dans un second temps via cette réaction bioorthogonale seront des fluorophores sensibles à leur environnement (notamment aux variations de pH), afin de suivre le devenir intracellulaire des formes actives de la MMP-12.

Axe 2 : Fonctionnalisation des différentes formes de la MMP-12 et identification d'une nouvelle génération d'aptamères
Les sondes développées dans l'axe 1 seront également utilisées pour fonctionnaliser différentes positions à la surface du domaine catalytique de la MMP-12. Une fois marqués, ces domaines catalytiques seront immobilisés via un système biotine-streptavidine afin de mettre en place une plateforme de criblage destinée à identifier des aptamères spécifiques. Ce travail sera réalisé en collaboration avec le laboratoire de Michael Ryckelynck (CNRS, Université de Strasbourg).
Parallèlement, le domaine hémopexine isolé ainsi que la proforme complète de la MMP-12 seront produits et modifiés par des approches de bioconjugaison régiosélective permettant leur immobilisation sur support solide. Ces conjugués serviront à réaliser un second criblage visant à identifier une autre génération d'aptamères capables de reconnaître spécifiquement les formes Pro et Hem de la MMP12

Axe 3 : Étude de la localisation cellulaire des différentes formes de la MMP-12
Les axes 1 et 2 permettront d'obtenir deux familles complémentaires d'outils moléculaires - sondes d'affinité et aptamères - destinées au suivi des différentes formes de la MMP-12 dans des systèmes cellulaires.
Ces outils seront utilisés pour réaliser des études d'imagerie par fluorescence sur différents types cellulaires cultivés seuls ou en co-culture, soumis ou non à divers stimuli biologiques tels que des infections virales ou bactériennes. L'objectif sera de déterminer la localisation subcellulaire des différentes formes de la MMP-12 et d'évaluer son évolution en fonction du contexte physiopathologique.