Thèse Decrypter l'Invisible Nouvelle Approche Analytique des Tanins par Spectrometrie de Masse H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut Agro Montpellier École doctorale : GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau Laboratoire de recherche : IATE - Ingénierie des Agropolymères et Technologies Emergentes Direction de la thèse : Laetitia MOULS ORCID 0000000278619685 Début de la thèse : 2026-11-01 Date limite de candidature : 2026-09-01T23:59:59 Des travaux menés au sein de l'UMR SPO ont permis la construction d'une base de données unique de marqueurs d'oxydation des tanins naturellement produits durant les procédés de transformation et de conservation des produits. Cependant, la caractérisation de la 'face cachée' des tanins reste à l'heure actuelle un verrou analytique. En particulier, les polymères de hauts poids moléculaires, tanins évolués (oxydés), ne sont pas directement accessibles avec les approches analytiques traditionnelles (LC-MS). Pourtant, la caractérisation des structures et la quantification de la fraction oxydée des tanins permettraient d'optimiser leur valorisation pour des applications industrielles existantes et d'en proposer de nouvelles. Afin de surmonter ce verrou, ce projet de thèse, en collaboration entre les UMR SPO et IATE, repose sur le développement d'une approche analytique de rupture innovante et multimodale, associant la mobilité ionique et la spectrométrie de masse, afin de déterminer l'état d'oxydation des tanins au niveau qualitatif et quantitatif. Cette approche se présente comme une alternative aux méthodes actuelles de dépolymérisation qui sont difficilement exploitables. En effet, dans cette nouvelle approche il s'agira d'étudier l'état d'oxydation des tanins en jouant sur les différences structurales entre unités oxydées et non oxydées grâce à une modulation des tensions en source et/ou dans la cellule de mobilité ionique. Le développement de cette approche sera basé sur l'analyse de solutions modèles dont la composition illustre d'une part la diversité structurale des tanins puis la complexité des compositions des produits/extraits naturels. Le suivi de ces solutions au cours du temps permettra de caractériser la progression de leur oxydation aussi bien qualitative (structures) que quantitative (proportion d'unités oxydées Les tanins condensés sont très largement répandus dans le règne végétal les domaines d'applications de cette nouvelle approche sont nombreux. Dans ce projet de thèse, nous étudierons, par spectrométrie de masse, des produits issus de la filière viticulture-oenologie et de la filière forêt-bois. Actuellement, des travaux menés à l'URM SPO (équipe BIO) ont permis la construction d'une base de données unique de marqueurs d'oxydation des tanins naturellement générés durant la transformation et le stockage des produits (1, 2). Après dépolymérisation chimique des tanins, les données recueillies après les analyses UHPLC-MS2 sont actuellement traitées manuellement, rendant l'opération chronophage et difficilement exploitable au niveau industriel.
Au travers de ce projet de thèse, nous nous proposons de développer une approche innovante disruptive d'analyse par tims-MS, permettant d'étudier et de caractériser l'état d'oxydation des tanins, sans dépolymérisation chimique. La réaction de dépolymérisation chimique utilisée jusqu'ici pour analyser et caractériser les tanins fait intervenir un agent nucléophile pour piéger, après rupture des liaisons inter-monomériques, les unités d'extension libérées. La durée de la réaction, la température à laquelle elle est réalisée, la neutralisation ou non du milieu après réaction et le temps au bout duquel l'analyse est réalisée sont autant de variantes qui peuvent influencer les résultats obtenus. La dépolymérisation des tanins dans l'instrument d'analyse présente un avantage majeur, générant des carbocations détectables par le spectromètre de masse. Les recherches de J.P. Salminen (Univ. Turku, Finlande) évaluent l'oxydation en se basant sur le rapport entre unités di-hydroxylées et tri-hydroxylées (3), alors que nos travaux montrent une diversité de marqueurs d'oxydation : motifs dimériques, trimériques avec divers degrés d'oxydation. La plateforme Polyphénols (PFP, UMR SPO) a acquis deux spectromètres de masse à très haute résolution, idéaux pour les approches métabolomiques. Nos avancées sur le tims-MS(4) et les motifs oxydés des tanins (2, 3, 5) nous poussent à caractériser davantage l'oxydation tout en simplifiant la méthodologie. Nous envisageons d'induire la dépolymérisation en appliquant des tensions à l'entrée du spectromètre ou/et dans la cellule de mobilité ionique. Ces tensions favorisent la fragmentation des ions, notamment la rupture de liaisons inter-monomériques des tanins oxydés. Ce projet de thèse explorera l'impact des tensions sur la fragmentation des tanins oxydés, visant à fragmenter les liaisons natives des tanins condensés tout en préservant celles issues de l'oxydation.
Au-delà de la possibilité de fragmenter des ions, la cellule de mobilité ionique offre une possibilité supplémentaire de séparer des ions co-élués en sortie de chromatographie, sur des critères liés à la surface exposée au gaz à contre-courant (taille et forme des ions), ce qui améliore l'analyse. La cellule de mobilité ionique est réputée performante pour la séparation des isomères, ce qui permet de supposer qu'elle devrait bien s'appliquer à la séparation des ions correspondant aux motifs oxydés,
qui sont le plus souvent des isomères de position et se distinguent par leur géométrie et leur forme.
En outre, l'instrument est équipé d'un logiciel de retraitement des données qui intègre de la modélisation de structures et fait de la prédiction de valeur du facteur de séparation des ions (CCS: Collisional Cross Section). Le doctorant bénéficiera d'un environnement de recherche dynamique avec un encadrement expert et un accès à des équipements de pointe en spectrométrie de masse. Cette recherche appliquée pourra ouvrir des perspectives dans des domaines variés allant de l'oenologie à la valorisation des sous-produits industriels.
Ce projet de thèse a pour objectifs de :
- Développer une nouvelle approche d'analyse des tanins sans dépolymérisation chimique : Accéder à l'analyse à large échelle de l'état d'oxydation des tanins grâce au développement d'une nouvelle approche analytique de rupture innovante par spectrométrie de masse de mobilité ionique (tims-MS).
- Comprendre les mécanismes d'oxydation et identifier de nouveaux marqueurs : Caractériser finement de la fraction tannique
- Améliorer la valorisation des tanins dans différents secteurs (vin, bois...) : (i) Connaître les relations structure(s) <-> caractéristique(s) organoleptique(s) -> Améliorer la qualité des produits grâce à une meilleure sélection de la matière première, un contrôle et une orientation des procédés de transformation et conditions de conservation ; (ii) Valoriser les sous-produits/co-produits. Une meilleure connaissance de leurs structures, notamment au regard de l'oxydation, est un pré-requis pour évaluer la qualité des extraits commercialisés, critère de choix pour les ingrédientistes ou les formulateurs.
- Optimiser l'analyse grâce à l'IA et au traitement avancé des données : Cette connaissance passe par le développement d'une nouvelle méthodologie, seulement possible sur des instruments de masse de dernière génération et grâce à des logiciels de traitement des données intégrant du machine learning et du traitement statistique. Une fois cette connaissance acquise, l'objectif sera de rechercher si une méthodologie plus simple ou une approche indirecte peut être envisagée et transférée vers les industriels.
La stratégie de l'étude proposée repose sur une complexification progressive des solutions de tanins qui seront analysées. Des solutions modèles judicieusement choisies permettront de produire et d'analyser indépendamment des motifs oxydés représentatifs de motifs oxydés intra-chaînes, des motifs oxydés représentatifs des liaisons inter-chaînes, en s'appuyant sur les résultats de récents travaux réalisés à l'UMR SPO visant à étudier des marqueurs d'oxydation de monomères de flavanols par mobilité ionique (4, 6). En outre, des cinétiques d'oxydation seront réalisées sur ces solutions et suivies au cours du temps pour obtenir et caractériser les divers degrés d'oxydation. Une fois que les différents types de motifs oxydés auront été bien caractérisés, des solutions modèles réalisées avec des tanins d'origines variées seront analysées.
1- Molécules modèles commerciales
La stratégie de travail vise à analyser progressivement des échantillons de complexité croissante.
L'étude commencera par l'analyse de molécules modèles pures, disponibles commercialement. Ces molécules représentent des degrés de polymérisation précis et des compositions en unités connues (Dimère d'épicatéchine B2, Dimère de type A, Trimère d'épicatéchine C1).
2- Fractions de tanins visant à explorer la diversité de ces polymères
L'objet des études qui seront réalisées dans le cadre de la thèse sont les tanins. Les tanins sont des structures polymères hétérogènes pour la plupart et varient en fonction de différents paramètres :
espèce végétale, organe, tissu, conditions pédoclimatiques, et stress subis par la plante. Ces composés sont généralement extraits par macération avec des mélanges de solvants hydro-alcooliques ou hydro-acétoniques. Les extraits peuvent être purifiés par une chromatographie flash et récupérés sous forme de fractions qui présentent des caractéristiques différentes, telles que la longueur moyenne des chaînes, ou la composition moyenne des unités. La première partie du travail consistera à, selon les
cas, isoler des fractions de tanins à partir de différentes matières premières (raisin, bois, vin...) ou purifier des extraits commerciaux afin d'explorer au mieux la diversité de ces polymères : homopolymères d'épicatéchine, tanins de type B et de type A, 5-deoxy tanins, tanins contenant une fraction importante d'unités gallo- ou/et gallates de catéchines.
3- Solutions plus ou moins oxydées
L'objectif étant de caractériser l'état d'oxydation des tanins, des solutions de molécules modèles et des solutions de fractions de tanins seront soumises à des réactions d'oxydation (auto-oxydation, oxydation enzymatique ou chimique) afin d'analyser de façon exhaustive les motifs d'oxydation et de les comparer en fonction du type d'oxydation. Les solutions oxydées seront analysées au cours du temps afin de caractériser l'évolution des produits avec le temps. Certains de ces descripteurs ont été partiellement caractérisés au laboratoire dans des travaux antérieurs, par l'analyse des solutions après dépolymérisation chimique. Cette méthode permet de déduire des informations sur la nature des unités impliquées dans les motifs d'oxydation (bouts de
chaîne versus extension) ainsi que sur le type d'oxydation (intra- versus inter-chaines). Les résultats obtenus avec la dépolymérisation en source et ou dans la cellule de mobilité ionique du spectromètre de masse pourront être comparés à ceux des analyses réalisées après dépolymérisation chimique des solutions.
La méthodologie développée sera appliquée à l'analyse de vins, qui correspondent à des solutions plus complexes combinant des compositions moléculaires plus diverses et/ou des modifications structurales autres que celles résultant de l'oxydation des tanins.
La spectrométrie de masse de mobilité ionique permet en effet d'accéder à une analyse à très haute résolution (HRMS). Ainsi, une étude de type métabolomique ciblée des motifs d'oxydation présents au sein des structures de tanins évolués obtenus après fragmentation en source (sur les échantillons complexes) pourra également être envisagée sur une série d'échantillons complexes. Cette étude
pourra être réalisée sur la base d'expériences de chromatographie liquide à ultra-haute performance (UHPLC) et HRMS acquises précédemment, et étendue aux approches non-ciblées grâce à des analyses multivariées et de réseaux moléculaires dont les méthodologies ont été développées par la PFP.