Thèse Etude de la Biophysique des Pores Nucléaires dans un Système Synthétique H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Montpellier
École doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
Laboratoire de recherche : CBS - Centre de Biologie Structurale
Direction de la thèse : Christine DOUCET ORCID 0000000216118279
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-11T23:59:59

Les pores nucléaires sont des régulateurs essentiels du transport nucléocytoplasmique. Ils forment des barrières sélectives qui permettent le passage rapide des molécules liées aux récepteurs de transport nucléaire (RTN) tout en excluant les macromolécules inertes. Bien que la structure des CPN soit aujourd'hui largement élucidée, l'organisation et les mécanismes fonctionnels des nucléoporines phénylalanine-glycine (FG-nups) au sein du canal central restent mal compris, notamment en ce qui concerne les changements conformationnels induits mécaniquement. Des données récentes indiquent que les CPN subissent une dilatation et une constriction en réponse aux variations de tension de l'enveloppe nucléaire, suggérant un lien direct entre les signaux mécaniques et la sélectivité du transport. Cependant, la manière dont ces transitions structurales modulent l'organisation et la perméabilité des FG-nups demeure inconnue.
Ce projet propose de relever ce défi en développant des modèles d'origami d'ADN, guidés par la structure, mimant les canaux centraux des CPN, comme plateforme expérimentale principale. Contrairement aux modèles simplifiés existants, ces nanopores artificiels intégreront des géométries en sablier réalistes, dérivées de structures à haute résolution, et organiseront spatialement plusieurs espèces de FG-nup afin de reproduire la stratification native. En construisant des nanopores d'ADN origami correspondant à des états dilatés et contractés, nous étudierons directement l'influence de la déformation mécanique sur la conformation, la densité et les interactions intermoléculaires des FG-nup.
Combinant le transfert d'énergie par résonance de Förster à molécule unique (smFRET), la microscopie électronique à transmission (MET) et des tests de transport fonctionnel dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV), ce travail établira des relations quantitatives entre la géométrie des pores, l'organisation des FG-nup et la perméabilité sélective. Des expériences parallèles sur des cellules soumises à des perturbations mécaniques permettront la validation et l'intégration dans un modèle unifié et multi-échelle de la fonction du complexe du pore nucléaire (NPC). En faisant de l'origami d'ADN un outil central pour la reconstruction et la manipulation de l'architecture des NPC, ce projet apportera des connaissances fondamentales sur les principes physiques régissant le transport sélectif dans les nanopores biologiques et révélera comment les forces mécaniques régulent ce processus cellulaire essentiel.

Les complexes de pores nucléaires (CPN) sont des assemblages macromoléculaires essentiels qui régulent le transport entre le noyau et le cytoplasme. Ces structures, d'environ 120 nm de large et 60 nm de haut, présentent une symétrie de rotation d'ordre 8 et contiennent un canal de transport central tapissé de nucléoporines (FG-nups), protéines intrinsèquement désordonnées et riches en phénylalanine-glycine. Ces protéines établissent une barrière de perméabilité sélective, permettant le transport rapide des molécules liées aux récepteurs de transport nucléaire (NTR) tout en excluant les macromolécules inertes de plus de 5 nm environ.

Malgré des progrès considérables dans la résolution de l'architecture des CPN, l'organisation et la dynamique fonctionnelle des FG-nups restent mal comprises, notamment en ce qui concerne la manière dont elles établissent et régulent la perméabilité sélective. Des données récentes indiquent que les CPN sont des structures mécanosensibles, subissant une dilatation et une constriction en fonction des conditions cellulaires telles que la tension de l'enveloppe nucléaire, le stress osmotique et la disponibilité énergétique. On suppose que ces transitions structurales influencent l'organisation des FG-nup et, par conséquent, la sélectivité du transport; toutefois, les mécanismes sous-jacents restent obscurs.

Les approches expérimentales actuelles sont limitées par la complexité et la nature dynamique des NPC in vivo. L'origami d'ADN s'est révélé un outil puissant pour la construction de nanopores biomimétiques; cependant, les modèles existants sont trop simplifiés, représentant généralement des géométries cylindriques et n'incorporant qu'un seul type de FG-nup. Ces modèles ne parviennent pas à reproduire des caractéristiques essentielles des NPC natifs, notamment l'organisation multicouche des FG-nup et la géométrie en forme de sablier des canaux.

Objectif 1: Développer des analogues de nanopores (NPC) par origami d'ADN
- Concevoir et assembler des nanopores par origami d'ADN reproduisant l'architecture interne des canaux centraux des NPC, à partir de données structurales à haute résolution (par exemple, conformations dilatées et contractées).
- Incorporer plusieurs espèces de FG-nup ancrées à des positions définies pour imiter l'organisation spatiale native.
- Reproduire des géométries en sablier et une dilatation différentielle dans la région équatoriale.

Objectif 2: Étudier l'organisation des FG-nup sous contraintes mécaniques
- Comparer le comportement des FG-nup dans des nanopores par origami d'ADN dilatés et contractés.
- Utiliser le transfert d'énergie par résonance de Förster à molécule unique (smFRET) pour sonder la dynamique conformationnelle et les interactions.
- Appliquer la microscopie électronique à transmission (MET) pour résoudre l'organisation structurale à l'échelle nanométrique. Objectif 3: Corréler la structure et la fonction de transport
- Intégrer des analogues de complexes de pores nucléaires (NPC) en origami d'ADN dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV) pour créer des systèmes de transport fonctionnels.
- Mesurer la sélectivité et la perméabilité du transport à l'aide de complexes fluorescents liés à la protéine de transport et à la protéine de transport nucléaire (NTR).
- Établir les relations entre:
La densité et l'agencement des nucléoporines fluorescentes (FG-nup)
La géométrie des canaux (dilatés ou rétrécis)
L'efficacité et la sélectivité du transport

DNA Origami Design and Assembly
-Use structure-guided design to fabricate nanopores mimicking NPC geometries.
-Functionalize inner surfaces with site-specific anchoring of FG-nups.
-Engineer variants corresponding to dilated and constricted states.
Structural Characterization
-TEM for morphological validation of DNA origami constructs.
-smFRET to monitor FG-nup conformational states and interactions in situ.
unctional Reconstitution
-Incorporate nanopores into GUV membranes to recreate selective transport environments.
-Perform transport assays using labeled cargoes of varying sizes and binding properties.
Cellular Correlation
-Apply mechanical perturbations (hyperosmotic shock, energy depletion) to cultured cells.
-Quantify changes in NPC structure, FG-nup abundance, and transport behavior.