Thèse Recherche de la Fonction des Protéines Bola d'Arabidopsis Thaliana dans la Croissance le Developpement et l'Adaptation Envionnementale H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Montpellier
École doctorale : GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau
Laboratoire de recherche : IPSiM - Institut des Sciences des Plantes de Montpellier
Direction de la thèse : Florence VIGNOLS ORCID 0000000220310407
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-07T23:59:59

Les centres Fe-S, formés d'atomes de fer (Fe) et de soufre (S), sont des cofacteurs protéiques essentiels impliqués dans des processus biologiques majeurs tels que le transfert d'électrons, les réactions redox et le repliement des protéines. Les protéines qui les nécessitent (protéines clientes) sont le plus souvent essentielles dans de nombreuses voies biologiques, elles-mêmes vitales le plus souvent. L'assemblage des centres Fe-S et leur distribution aux protéines clientes reposent sur trois machineries cellulaires spécifiques chez les eucaryotes : SUF (plastes), ISC (mitochondries) et CIA (cytoplasme). Si de nombreuses composantes de ces machineries sont bien caractérisées, les étapes tardives de trafic et d'incorporation des centres Fe-S au sein des protéines clientes restent peu comprises, en particulier chez les plantes.

Chez les végétaux, les centres Fe-S sont cruciaux, entre autres, pour la photosynthèse, le métabolisme de l'azote et du soufre, ou encore que la biosynthèse d'hormones, influençant la croissance et l'adaptation environnementale. Arabidopsis thaliana compte environ 200 protéines clientes à centres Fe-S, souvent essentielles mais sans similitude de séquence ou de fonction. Or seule une trentaine de protéines navettes de centres Fe-S a été identifiée, soulevant de nombreuses questions sur les mécanismes de reconnaissance protéique entre cliente et navette. Comprendre l'assemblage des centres Fe-S chez les plantes et identifier les facteurs des machineries d'assemblage est donc crucial, à la fois pour comprendre et améliorer la productivité agricole, mais également pour développer de nouvelles stratégies d'amélioration des plantes.

Le projet de thèse proposé se concentre sur les protéines BOLA d'Arabidopsis (BOLA1, BOLA2 et BOLA4), connues pour interagir avec des navettes Fe-S comme les glutaredoxines de type CGFS et les protéines NFU. Bien que leur rôle précis reste flou, nous avons montré que BOLA1 et BOLA4 (redondantes, plastidiales et mitochondriales) sont impliquées dans la répartition du fer et son homéostasie selon un mécanisme divergent de celui de BOLA de levure. Elles sont également impliquées dans la respiration mitochondriale, la régulation de l'auxine, et le dialogue plaste-noyau, ce dernier nécessitant une investigation plus poussée. BOLA2, l'isoforme nucléo-cytoplasmique de la famille, a fait l'objet d'une seule publication controversée, et reste sans fonction connue.

L'objectif de la thèse sera donc de contribuer à éclaircir les zones d'ombre sur les fonctions des protéines BOLA d'Arabidopsis thaliana, par la mise en place d'approches expérimentales utilisant une large gamme de méthodes telles que l'ingénierie génétique, les approches OMICS (protéomique, métabolomique, ionomique et transcriptomique), la bioinformatique, et la modélisation de complexes. En examinant le rôle fonctionnel des protéines BOLA chez cette plante modèle, ce projet vise à approfondir notre compréhension de l'assemblage des centres Fe-S et de son impact sur la biologie des plantes et à faciliter des découvertes aux implications larges et potentiellement importantes en agronomie.

Les protéines BolA sont des protéines ubiquitaires, dépourvues de fer et de soufre à l'état monomérique, et identifiées pour la première fois chez la bactérie Escherichia coli comme produits par des morphogènes marqueurs de la réponse aux stress osmotiques et oxydants (1-3). Répertoriées au nombre de 4 (BOLA1 à BOLA4), elles sont classées en deux groupes selon la taille d'une boucle flexible au sein de leur structure (appelée [H/C loop]). Cette boucle qui les distingue contient soit un résidu cysteine conservé (constituant le groupe des BOLA_C), soit un résidu histidine conservé (groupe des BOLA_H) (4,5). Certaines BOLA n'existent que chez l'homme et les mammifères (BOLA3), d'autres ne sont présentes que chez les plantes et algues vertes (BOLA4).

Les protéines BOLA ont la capacité d'interagir physiquement avec des Glutarédoxines (Grx) de type CGFS (Grx-CGFS), propriété démontrée chez les bactéries et chez de nombreux eucaryotes y compris chez les plantes (5-9). Les Grx-CGFS constituent la classe-II des glutarédoxines dont la fonction première est la déglutathionylation des protéines par le biais de leur site actif monothiol CGFS. Mais elles ont également la propriété de former des holo-homodimères comportant un centre Fe-S [2Fe-2S] et de transférer leur centre Fe-S à des apo-protéines présentes dans différents compartiments. L'interaction des protéines Grx-CGFS avec des protéines BolA déplacerait cet holo-homodimère Grx-CGFS vers la formation d'un hétérodimère à un centre [2Fe-2S] plus stable tout en modifiant l'environnement du centre Fe-S à délivrer à des apo-protéines. Nos données préliminaires montrent que les protéines BOLA1 et BOLA4 d'Arabidopsis thaliana interagissent également avec une autre famille de navettes de centres Fe-S (les protéines NFU) (Rodriguez-Euzet et al., en préparation). D'autres travaux révèlent une autre propriété des protéines BolA en lien avec l'homéostasie du fer. Chez la levure, la protéine Aft1 est le principal facteur de transcription activant l'expression des gènes impliqués dans le métabolisme du fer et en particulier ceux codant les transporteurs à haute affinité requis en situation de carence ferrique (10-12). En situation normale de disponibilité en fer, ce facteur Aft1 serait retenu dans le cytoplasme par un complexe comprenant les protéines Grx-CGFS Grx3 et Grx4 et la protéine BOLA-like Fra2 via la formation d'un centre [2Fe-2S], auquel s'adjoindrait également une aminopeptidase (13-15). La formation de ce complexe serait due à un signal qui prendrait sa source depuis la machinerie ISC de la mitochondrie, favorisant le retrait de Aft1 de ses sites de liaison à l'ADN spécifiques et sa rétention dans le cytoplasme (16-18). D'autres travaux chez Schizosaccharomyces pombe montrent également que la protéine orthologue BOLA/Fra2 est requise pour l'inactivation Grx-dépendante du facteur de transcription répresseur Fep1 en réponse à une carence en fer. Ces données pourraient être mises en lien avec un motif HTH (helix-turn-helix) dans une région de la protéine qui pourrait constituer un site de liaison à l'ADN (8,19). Les BOLA pourraient donc se comporter comme des régulateurs transcriptionnels.

Chez les plantes, peu d'informations étaient disponibles au début de nos travaux. Chez Arabidopsis, le génome nucléaire code pour 3 protéines BOLA (BOLA1 et BOLA4 de type H, BOLA2 de type C). Au cours de nos travaux (4), nous avons pu montrer qu'à l'instar d'autres organismes, les protéines BOLA d'Arabidopsis résident dans différents compartiments de la cellule dans lesquels coexistent également une ou plusieurs protéines Grx-CGFS canoniques ou multi-domaines (8,10). BOLA1, BOLA4 GrxS14 et GrxS16 résident dans le chloroplaste, BOLA1, BOLA4 et GrxS15 résident également dans la mitochondrie, BOLA2 et GrxS17 sont quant à elles nucléocytoplasmiques (4). Plusieurs interactions binaires BOLA/Grx-CGFS ont été identifiées en système hétérologue dans la levure (Y2H) et par BiFC dans des protoplastes, sans qu'une fonction à ces complexes établis in vivo puisse être testée à cette époque (8). Nos récents résultats sur les protéines BOLA montrent que la perte de fonction cumulée des gènes AtBOLA1 et AtBOLA4 induit une forte diminution, voire la perte totale de certaines protéines à centre Fe-S de la mitochondrie et du chloroplaste, que nous avons identifiées grâce à la comparaison du protéome d'un double mutant bola1bola4 avec celui d'une lignée sauvage Col0. La double mutation bola1bola4 induit également un phénotype nain, une profonde modification de l'architecture racinaire avec un arrêt de la croissance de la racine principale, et une perturbation de la distribution du fer dans la plante, corroborée par l'altération de certains transporteurs de ce métal dans le double mutant. Deux articles de l'équipe sont en cours de préparation ou soumis. Le premier met en en évidence le rôle de BOLA1 et BOLA4 dans la répartition du fer dans la plante et son homéostasie (*Rodriguez-Euzet A, *-BrogginiM co-auteurs et al., en préparation). Néanmoins, il est difficile d'associer BOLA1 et BOLA4 avec une fonction de régulateurs transcriptionnels dans la nutrition ferrique en raison de leur localisation subcellulaire. Compte tenu de la perturbation de certains médiateurs du dialogue moléculaire entre plaste et noyau, notre hypothèse, qui reste à démontrer, serait une action indirecte de BOLA1 et BOLA4 sur le génome nucléaire. Une autre partie des travaux de la thèse Anaïs Rodrigyez-Euzet avec le concours de deux stagiaires (M. Houle, L3Pro-MEV, Montpellier ; A. Rigaud, M2-BIPA, Montpellier) montre le rôle prépondérant de BOLA1 et BOLA4 dans la biosynthèse de l'auxine (Rodriguez-Euzet et al., en cours de rédaction). Quant à BOLA2, seule une publication suggère que cette protéine d'Arabidopsis jouerait un rôle de répresseur dans la tolérance à l'excès de fer et au stress oxydant induit par le méthyl-Viologen (20), une hypothèse que contraste avec la sensibilité de deux mutants bola2 au peroxyde d'hydrogène étudiés dans l'équipe (Sudre D, non publié). La fonction de cette troisième isoforme de la famille BOLA reste donc à décrypter.

Le projet de thèse s'inscrit dans une recherche visant à identifier le rôle des protéines BOLA chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Les protéines BolA sont suspectées de contribuer à l'assemblage et à la livraison de fer sous forme de centres Fer-Soufre (Fe-S) à de nombreuses protéines clientes qui nécessitent ces cofacteurs pour exercer de nombreuses fonctions dans la plante.

Une première partie de la thèse sera consacrée à compléter les données obtenues par une doctorante financée par l'école doctorale GAIA-Bidap 2022-2025 sur les protéines plastidiales/mitochondriales BOLA1 et BOLA4, en particulier sur leur rôle dans la voie de biosynthèse de l'auxine et dans le dialogue moléculaire entre le plaste et le noyau.

Une deuxième partie de la thèse sera d'explorer le rôle de la protéine nucléo-cytoplasmique BOLA2, 3ème isoforme de la famille des BOLA pour laquelle peu de données fonctionnelles sont disponibles. Sa contribution aux fonctions de la glutarédoxine GXRS17, seul interactant connu de cette BOLA, dans la réponse et l'adaptation aux stress environnementaux en particulier, sera recherchée.

Enfin, une recherche plus exploratoire sera d'évaluer le rôle potentiel de BOLA2 dans la régulation de voies hormonales, suggéré par des travaux préliminaires de recherche d'interactants chez Arabidopsis.

Les méthodes à mettre en oeuvre au cours de la thèse incluent :
*Méthodes de biologie moléculaire (clonage /mutagénèse dirigée, PCR, qRT-PCR),
*Méthodes de génétique : génotypages, croisements génétiques
*Transgénèse (T-DNA et Crispr-Cas9), expression stable et transitoire in planta.
*Interactomique : tests binaires et criblages de banques en systèmes double et triple hybrides en levure en levure, tests de complémentation fonctionnelle par BiFC (Bi-molecular fluorescence complementation), Flim-Fret
*Proteomique : préparation d'échantillons pour analyses par Label free HPLC-MS/MS par une plateforme
*Ionomique et metabolomique: préparation d'échantillons pour analyses par des plateformes (collaborations externes)
*Transcriptomique : réseau de gènes
*Interactions protéine/ADN (ChIP-seq, selex), éventuellement collaboration avec le CBS de Montpellier pour travaux de modélisation
*Microbiologie (culture et transformation de bactérie et levures),
*Microscopie à épifluorescence et confocale, préparation de protoplastes