Thèse Formulation de Vésicules Extracellulaires par Atomisation-Séchage pour le Traitement des Maladies Pulmonaires Inflammatoires par Inhalation H/F

Doctorat_Gouv

Les maladies respiratoires affectent un demi-milliard de personnes dans le monde, représentant la troisième cause de décès. Les traitements actuels contre l'inflammation, principalement à base de corticostéroïdes, sont limités par leurs effets secondaires et l'apparition de résistances, soulignant l'urgence de développer des alternatives. Les vésicules extracellulaires (VEs) sécrétées par les cellules souches mésenchymateuses offrent une piste prometteuse, ayant démontré des propriétés anti-inflammatoires dans des modèles précliniques de maladies respiratoires. Cependant, le transfert de cette solution thérapeutique vers la clinique fait face à un obstacle majeur : l'administration par inhalation de suspensions liquides de VEs n'est pas viable, à cause des faibles quantités délivrées et de leur faible stabilité.
Dans ce projet, nous souhaitons relever ce défi en concevant de nouvelles formulations de VEs anti-inflammatoires, sous forme de poudres inhalables obtenues par atomisation-séchage. Le premier objectif sera de produire des formulations sèches de VEs présentant des propriétés adaptées à l'administration pulmonaire tout en préservant l'intégrité et les propriétés biophysiques des VEs. Nous évaluerons ensuite les propriétés anti-inflammatoires des VEs séchées dans des modèles d'inflammation pulmonaire. En cas de succès, ce projet constituera une avancée significative dans le domaine des traitements pulmonaires à base de VEs. En outre, l'amélioration attendue de la stabilité de stockage et la manipulation plus aisée des poudres obtenues devraient accroître l'accessibilité et la facilité d'utilisation des biothérapies à base d'EV.

Les maladies respiratoires constituent un problème de santé publique majeur, représentant la troisième cause de décès dans le monde. En particulier, l'incidence des pathologies pulmonaires inflammatoires, telles que la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), l'asthme ou la fibrose, a connu une forte augmentation ces dernières décennies. Une tendance qui est appelée à perdurer puisque l'exposition à la pollution atmosphérique est un facteur de risque reconnu. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des traitements anti-inflammatoires qui permettent d'offrir une alternative aux corticostéroïdes habituellement utilisés, qui peuvent induire l'apparition d'effets secondaires indésirables ou de résistances. Les VEs constituent une piste intéressante, en particulier celles produites par les cellules souches mésenchymateuses (CSMs), puisque elles ont démontré des effets anti-inflammatoires au niveau du poumon.1,2 Ainsi, les VEs dérivées de CSMs administrées par inhalation ont le potentiel pour devenir un nouveau traitement des maladies respiratoires inflammatoires. Cependant, la nébulisation des VEs comporte de nombreux défauts : (i) les VEs peuvent facilement s'agréger et se dégrader durant la nébulisation, ce qui peut affecter leurs effets thérapeutiques et leur efficacité de délivrance ; (ii) il est difficile de délivrer des doses thérapeutiques efficaces à cause de la viscosité élevée des suspensions concentrées des VEs ; (iii) les VEs sont instables en cas de stockage à long terme sous forme de suspensions aqueuses, ce qui nécessite des conditions de stockage restrictives (-80°C).

Administrer des VEs aux patients par inhalation pourrait ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les pathologies pulmonaires inflammatoires, mais que la nébulisation de suspensions liquides de VEs n'offre pas une solution cliniquement viable. Le développement d'un système de délivrance alternatif est donc primordial pour pouvoir exploiter les bénéfices thérapeutiques des VEs. Ce projet a pour objectif de relever ce défi en concevant de nouvelles formulations de VEs dérivées des CSMs pour le traitement de l'inflammation pulmonaire, sous forme de poudres inhalables obtenues par atomisation-séchage. Cet objectif principal peut être divisé en trois axes de recherche :
1.Produire par atomisation-séchage des poudres de VEs ayant des propriétés adaptées à l'administration pulmonaire ;
2.Caractériser les VEs avant et après atomisation-séchage pour s'assurer de la préservation de leur intégrité et leurs propriétés biophysiques ;
3.Evaluer les propriétés anti-inflammatoires des VEs séchées dans des modèles d'inflammation pulmonaire.

Les méthodologies suivantes seront appliquées pour répondre aux trois objectifs. A noter que les deux premiers objectifs seront d'abord réalisés avec des VEs commerciales dérivées du lait bovin, qui sont facilement disponibles en grandes quantités. Ce système modèle nous permettra d'optimiser les méthodes et les protocoles avant de passer aux VEs thérapeutiques.
1.Produire par atomisation-séchage des poudres de VEs ayant des propriétés adaptées à l'administration pulmonaire
L'atomisation-séchage des VEs se fera selon une variété de conditions, en faisant varier la composition (nature des excipients, ratio excipients/VEs) et les paramètres du procédé (température de séchage). La taille des poudres obtenues sera caractérisée par granulométrie laser, et leur morphologie par microscopie électronique à balayage (MEB). Leur aérosolisation sera évaluée à l'aide d'un impacteur multi-étages, comme recommandé par la Pharmacopée Européenne.

2.Caractériser les VEs avant et après atomisation-séchage pour s'assurer de la préservation de leur intégrité et leurs propriétés biophysiques
La concentration et la taille des VEs seront mesurées par analyse du suivi individuel de particules (NTA). Leur potentiel zeta sera déterminé par mesure de la mobilité électrophorétique, et leur morphologie sera observée par cryo-microscopie électronique en transmission (cryoMET). Divers tests biochimiques seront également utilisés pour évaluer la quantité totale de protéines et d'acides nucléiques. La présence de marqueurs spécifiques des VEs pourra être étudiée par cytométrie de flux, avec des kits commerciaux de multiplexage qui détectent les épitopes de surface des VEs via des billes de capture recouvertes d'anticorps. La stabilité à long terme des formulations sera enfin étudiée sous diverses conditions de stockage.
3.Evaluer les propriétés anti-inflammatoires des VEs séchées dans des modèles d'inflammation pulmonaire
Des tests in vitro seront tout d'abord réalisés avec un modèle d'inflammation obtenu en exposant des macrophages alvéolaires murins à des lipopolysaccharides (LPS).3 On utilisera par la suite des épitheliums reconstruits à partir de cellules humaines primaires, qui sont disponibles commercialement (MucilAir™ et AlveolAir™, Epithelix). Les propriétés anti-inflammatoires des VEs non formulées et séchées seront comparées en analysant la polarisation des macrophages et la libération de cytokines dans ces différents modèles. On vérifiera également la non-toxicité des formulations via des tests de prolifération et de viabilité cellulaires. Si ces tests in vitro donnent des résultats prometteurs, on pourra considérer une validation in vivo, en utilisant un modèle murin exposé aux LPS.