Thèse CD - Vers de Nouvelles Stratégies Thérapeutiques pour les Gliomes Diffus de la Ligne Médiane H3k27m Altérés Ciblage des Mécanismes de Stabilisation Adaptative de l'État Tumoral H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Nous posons l'hypothèse que l'inhibition sélective de ces réseaux de maintien adaptatif (i) réduit la viabilité et la clonogénicité des cellules DMG, (ii) désorganise la cohérence transcriptionnelle OPClike, et (iii) favorise une sortie de l'état tumoral, par différenciation forcée ou perte de viabilité.

Le projet s'articule en trois volets.
(1) Analyse unicellulaire multicohortes : les données singlecell publiées de qualité seront réanalysées afin de cartographier, à haute résolution, l'engagement des différents réseaux de stress selon les états tumoraux et le long des transitions développementales aberrantes caractéristiques des DMG.
(2) Génération de données omiques dérivées de nos propres patients : pour valider et étendre ces observations, nous produirons nos propres données bulk RNAseq à partir de modèles cellulaires DMG dérivés de patients diagnostiqués via notre réseau neuropathologique. Selon la qualité du matériel disponible, des analyses unicellulaires ciblées pourront être envisagées pour clarifier certains axes de protéostase.
(3) Validation fonctionnelle et démonstration causale : les dépendances adaptatives identifiées seront testées expérimentalement dans plusieurs lignées DMG indépendantes via inhibitions pharmacologiques et perturbations géniques CRISPRi. Les analyses intégreront des mesures de viabilité, clonogénicité, activation/déficience des voies de stress, ainsi que des tests d'inductibilité permettant de vérifier la capacité des cellules à mobiliser dynamiquement ces réseaux.

L'objectif final est d'identifier des vulnérabilités adaptatives reposant sur des mécanismes de stabilisation cellulaire indispensables, et d'ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques fondées non sur le ciblage d'un oncogène unique, mais sur la déstabilisation du système de maintien identitaire des cellules DMG H3K27M. Cette approche propose un changement de paradigme pour une pathologie où les options thérapeutiques restent dramatiquement limitées.
Les gliomes diffus de la ligne médiane (DMG), incluant les gliomes intrinsèques diffus du pont (DIPG), représentent l'une des pathologies oncologiques pédiatriques les plus sévères. Malgré une prise en charge optimisée et l'utilisation systématique de la radiothérapie, la survie médiane globale demeure d'environ 10-12 mois [3], et aucune thérapie ciblée n'a permis d'améliorer significativement le pronostic. Cette impasse thérapeutique suggère l'existence d'un verrou biologique fondamental encore insuffisamment compris.
Sur le plan moléculaire, les DMG sont caractérisés par une mutation récurrente des histones H3 (H3.1 ou H3.3), dite H3K27M, substituant la lysine 27 par une méthionine. Cette onco-histone inhibe le complexe PRC2, entraînant une perte globale et une redistribution aberrante de la marque répressive H3K27me3. Il en résulte une désorganisation profonde des programmes transcriptionnels de différenciation des lignées neuronales, principalement oligodendrocytaires. Contrairement aux glioblastomes de l'adulte, ces tumeurs présentent relativement peu d'altérations génétiques additionnelles, ce qui suggère que l'instabilité épigénétique constitue l'événement fondateur et dominant de la transformation.
Les analyses transcriptomiques unicellulaires récentes [1,2] ont profondément renouvelé notre compréhension de l'architecture cellulaire des DMG. Elles montrent que ces tumeurs ne correspondent pas à une population homogène hyperproliférative, mais s'organisent selon des états développementaux pathologiques dominés par des cellules de type progéniteur oligodendrocytaire (OPC like), associant prolifération et blocage partiel de différenciation. Les axes d'identité progénitrice et de prolifération apparaissent partiellement dissociables, suggérant que la tumeur correspond à un état développemental anormalement stabilisé plutôt qu'à une simple expansion clonale.
Ce cadre conceptuel fait émerger une question biologique centrale : comment un état cellulaire à la fois épigénétiquement désorganisé, transcriptionnellement instable et soumis à un environnement neuronal hautement actif, notamment dans le contexte de stades précoces du développement cérébral, peut il être maintenu durablement ? En effet, l'érosion épigénétique induite par H3K27M devrait théoriquement compromettre la stabilité des programmes d'identité cellulaire. De plus, la combinaison d'un blocage de différenciation, d'une prolifération soutenue et d'une stimulation neuronale chronique devrait générer une contrainte protéotoxique, métabolique et génomique élevée. Pourtant, les cellules tumorales persistent, se maintiennent et conservent une identité cohérente sur plusieurs mois d'évolution clinique. Ce paradoxe suggère l'existence de mécanismes actifs de stabilisation adaptative, impliquant potentiellement non seulement la protéostase mais aussi des voies amont de préservation de l'intégrité cellulaire, telles que les réponses aux dommages de l'ADN et d'autres systèmes de contrôle qualité.
La protéostase, ensemble des mécanismes assurant le repliement correct, la dégradation et le contrôle qualité des protéines, constitue en effet un système adaptatif majeur dans les cellules soumises à des contraintes intenses. Elle inclut notamment la réponse intégrée au stress (ISR), la réponse au stress du réticulum endoplasmique (UPR_RE), la protéostase mitochondriale (UPR_mt), les systèmes ubiquitine protéasome et autophagie. Si ces voies sont classiquement décrites comme des réponses transitoires à un stress aigu, des travaux récents montrent qu'une activation chronique et modulée de ces réseaux peut stabiliser des états cellulaires plastiques ou instables, notamment dans des contextes de différenciation bloquée ou de reprogrammation cellulaire [4,5].
Nous formulons ainsi l'hypothèse que les réseaux de protéostase et, plus largement, les systèmes cellulaires de maintien de l'intégrité (incluant certaines réponses au stress génotoxique), ne constituent pas seulement des réponses secondaires au stress tumoral, mais participent activement à la stabilisation adaptative de l'état OPC-like pathologique dans les DMG H3K27M altérés.
Afin d'explorer cette hypothèse, nous avons réanalysé préliminairement deux modèles murins complémentaires exprimant H3K27M. Dans le cerveau embryonnaire E14.5 (GSE120882) [6], nous observons une augmentation directionnelle des signatures ISR, UPR_RE et heat shock associée à une augmentation de l'entropie transcriptionnelle, suggérant qu'un stress lié au repliement protéique accompagne l'instabilité identitaire précoce. À l'inverse, dans un modèle tumoral RCAS/tva établi (GSE184935) [7], les signatures dominantes concernent l'UPR_mt et l'autophagie/lysosome, indiquant un remodelage adaptatif distinct à un stade tumoral consolidé. Ces observations soutiennent un modèle dynamique dans lequel les réseaux de protéostase se réorganisent progressivement au cours de la transition entre instabilité développementale initiale et consolidation tumorale.
À ce jour, aucune étude n'a analysé de manière systématique, à résolution single-cell et dans des DMG humains, l'engagement différentiel des réseaux de protéostase en fonction des états tumoraux. Les travaux existants ont principalement décrit l'hétérogénéité cellulaire et les programmes développementaux, sans examiner explicitement les mécanismes susceptibles de stabiliser ces états.
L'originalité du projet réside ainsi dans le changement de perspective proposé : analyser la protéostase non comme une réponse au stress tumoral, mais comme un mécanisme structurant de stabilisation d'un état épigénétiquement instable. L'identification de dépendances adaptatives associées à cette stabilisation pourrait révéler des vulnérabilités thérapeutiques exploitables, fondées sur la déstabilisation sélective de l'état tumoral plutôt que sur le ciblage d'oncogènes classiques.
Le projet est structuré pour produire des résultats publiables en trois ans, articulant cartographie unicellulaire, validation fonctionnelle dans des modèles dérivés de patients, et démonstration causale des dépendances identifiées. Objectif général
Identifier et valider des vulnérabilités adaptatives liées aux réseaux de protéostase dans les gliomes diffus de la ligne médiane (DMG) H3K27M, afin d'ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques fondées sur la déstabilisation sélective de l'état tumoral.

Objectif 1 - Cartographier l'engagement des voies de protéostase dans les DMG à résolution unicellulaire.
Réanalyser les jeux de données singlecell publiés (Filbin et al., 2018 ; Liu et al., 2022) afin de caractériser et quantifier l'activation des voies ISR, UPR du réticulum endoplasmique (UPR_RE), UPR mitochondriale (UPR_mt), ubiquitine-protéasome et autophagie selon les différents états tumoraux (OPClike, prolifératif, partiellement différencié). Cette étape permettra d'identifier les axes de dépendance les plus robustes et de prioriser les cibles fonctionnelles à explorer expérimentalement.

Objectif 2 - Valider expérimentalement les signatures de protéostase identifiées.
Générer des données transcriptomiques bulk RNAseq à partir de modèles cellulaires dérivés de patients afin de confirmer la robustesse et la reproductibilité des signatures observées in silico. Réaliser des validations fonctionnelles ciblées (peIF2/ATF4, XBP1s, ATF5/HSPD1/LONP1, flux autophagique, activité protéasomale, paramètres OCR/ECAR) afin d'évaluer la charge protéostatique et l'impact des voies de stress sur la viabilité, la prolifération et la stabilité de l'état OPClike.

Objectif 3 - Tester causalement les dépendances adaptatives identifiées.
Explorer les cibles prioritaires ( 5) par inhibition pharmacologique et par répression génique via CRISPRi dans des modèles DMG dérivés de patients. Déterminer si leur inhibition provoque (i) une déstabilisation sélective de l'état tumoral OPClike, (ii) une diminution de la capacité clonogénique, et (iii) une altération de la viabilité cellulaire, validant leur rôle causal dans le maintien de l'identité tumorale. L'hypothèse centrale du projet est que les réseaux de protéostase ne constituent pas uniquement une réponse secondaire au stress tumoral, mais participent activement à la stabilisation adaptative des états cellulaires OPC-like dans les DMG H3K27M-altérés [3]. Pour tester cette hypothèse de manière structurée, le projet progresse en trois niveaux complémentaires : une cartographie directionnelle à résolution unicellulaire, une validation fonctionnelle des signatures identifiées, puis une démonstration causale de leur nécessité pour le maintien de l'état tumoral. Toutes les validations expérimentales seront réalisées sur des modèles cellulaires dérivés de patients, sans recours à des modèles animaux.
Dans un premier temps, nous analyserons des jeux de données scRNA-seq humains de référence ([1-2]), sélectionnés pour leur profondeur de séquençage et la qualité des données et leurs annotations, ainsi que leur capacité à distinguer, au sein d'un même échantillon, des états OPC-like, prolifératifs et différenciés. Cette résolution est indispensable pour déterminer si les voies de protéostase s'associent de manière spécifique à certains états tumoraux.
Les matrices brutes seront retraitées sous Seurat selon un pipeline standardisé intégrant la normalisation SCTransform [8], la détection des doublets par DoubletFinder [10] et l'intégration inter-échantillons via Harmony [9,11]. Les états cellulaires définis dans les travaux originaux seront conservés afin de garantir une comparabilité rigoureuse entre cohortes.
L'activité des principales voies de protéostase sera évaluée par des scores GSVA [12], construits à partir de modules mécanistiquement définis issus de MSigDB et de la littérature. Seront analysées l'Integrated Stress Response (ISR ; ATF4/DDIT3), dont la plasticité adaptative récemment décrite souligne son rôle potentiel dans la stabilisation d'états cellulaires instables [4,5], l'UPR du réticulum endoplasmique (IRE1/XBP1s, PERK, ATF6), l'UPR mitochondriale (ATF5-HSPD1-LONP1), le système ubiquitine-protéasome et l'autophagie. Des signatures complémentaires, telles que la réponse aux dommages de l'ADN ou les modules de contrôle qualité mitochondrial, pourront être intégrées lorsque pertinent, afin d'identifier d'éventuels réseaux coopératifs impliqués dans la stabilisation tumorale.
Les trajectoires cellulaires seront reconstruites par analyses de pseudotemps (Slingshot, Monocle3) afin d'examiner si l'activation des voies étudiées précède, accompagne ou suit les transitions OPC-like prolifératif différencié. Les comparaisons statistiques reposeront sur des modèles linéaires mixtes intégrant un effet aléatoire « patient », avec correction des tests multiples (FDR <0,05). Un module sera considéré comme impliqué dans la stabilisation tumorale s'il présente une activation différentielle significative, une cohérence directionnelle le long des trajectoires et une reproductibilité dans au moins deux cohortes indépendantes.
Des données préliminaires issues de deux modèles murins H3K27M publiés ([6-7]) montrent une réorganisation temporelle des voies de stress, avec une prédominance des signatures ISR et UPR du réticulum endoplasmique à un stade embryonnaire instable, puis une activation accrue de l'UPR mitochondriale et de l'autophagie à un stade tumoral consolidé. Bien que ces modèles ne reproduisent pas directement les états OPC-like humains, ils soutiennent l'hypothèse d'une adaptation progressive des réseaux de maintien entre instabilité développementale et identité tumorale stabilisée, justifiant l'analyse unicellulaire chez l'humain.
Afin de consolider les observations issues des données publiques, des analyses bulk RNA-seq seront générées à partir de modèles DMG dérivés de patients du réseau BIOMEDE2, avec préparation des librairies et séquençage via la plateforme GenomEast (Strasbourg). Ces données permettront d'évaluer la robustesse inter-modèles des signatures identifiées.