Thèse Régulation de la Fonction de la Protéine Tau par l'O--N-Acétylglucosaminylation H/F

Université de Lille

Établissement : Université de Lille
École doctorale : Biologie Santé de Lille
Laboratoire de recherche : Facteurs de risque et déterminants moléculaires des maladies liées au vieillissement
Direction de la thèse : Caroline SMET-NOCCA ORCID 0000000297930882
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-04-28T23:59:59

L'inhibition de l'O--N-acétylglucosaminyl hydrolase (OGA) est une approche envisagée dans le traitement des tauopathies, groupe de maladies neurodégénératives associées à un dysfonctionnement de la protéine neuronale Tau, incluant la maladie d'Alzheimer. Avec l'OGA, l'O-GlcNAc transférase (OGT) est l'unique enzyme impliquée dans la dynamique de l'O--N-acétylglucosaminylation (O-GlcNAcylation), une modification post-traductionnelle capable de réguler la fonction des protéines et leur phosphorylation. Dans des modèles de souris, il a été montré que l'O-GlcNAcylation pourrait réguler l'hyperphosphorylation de Tau et empêcher son agrégation fibrillaire associée aux processus neurodégénératifs, notamment en stabilisant une forme soluble non toxique. Cependant, une augmentation pharmacologique de l'O-GlcNAcylation par des inhibiteurs d'OGA testés en phase clinique n'a pas montré d'effet sur les capacités cognitives des patients bien qu'une diminution de la pathologie Tau ait été observée.
Nous proposons de développer de nouveaux outils permettant de favoriser spécifiquement la formation de formes O-GlcNAcylées de la protéine Tau. Dans ce projet, nous allons produire et caractériser de nouvelles molécules hybrides nanobody-OGT' qui ciblent spécifiquement la protéine Tau et augmentent sa modification par O-GlcNAcylation. Nous allons produire différents variants nanobody-OGT ciblant différentes régions de Tau et caractériser au niveau analytique et fonctionnel, les formes O-GlcNAcylées de Tau générées par ces composés. Une co-expression de Tau et des nanobody-OGT dans des neurones dérivés d'iPSC, cultivés en systèmes microfluidiques, permettra de décortiquer le rôle des nanobody-OGT sur les modifications post-traductionnelles de Tau, sa capacité de propagation de neurone en neurone et de seeding de l'agrégation fibrillaire. Cette approche constitue une alternative thérapeutique innovante aux inhibiteurs d'OGA et de kinases en ciblant spécifiquement l'O-GlcNAcylation de la protéine Tau dans le traitement des maladies neurodégénératives.

Au niveau clinique, la vitesse du déclin cognitif, associé à la progression de la MA, varie fortement d'un patient à l'autre et la propagation des agrégats de Tau dans le cortex est étroitement liée à la sévérité des symptômes. L'hétérogénéité observée dans la progression de la pathologie entre les patients semble liée aux propriétés de seeding de Tau, elles-mêmes liées à certaines modifications post-traductionnelles (MPT). Des études ont établi une corrélation entre des profils de phosphorylation de Tau, impliquant des phosphorylations spécifiques, l'activité de seeding et l'agressivité de la pathologie Alzheimer au niveau clinique. Le dialogue de la phosphorylation de Tau avec d'autres MPT telles que l'O-GlcNAcylation des sérine/thréonine a été évoquée comme mécanisme potentiel pour contrer l'hyperphosphorylation et ses conséquences sur les fonctions de Tau.
La caractérisation de la phosphorylation de Tau est très difficile en raison du nombre de résidus Ser/Thr potentiels (80 sites), du nombre de kinases et de leurs différents profils de phosphorylation. Les profils de phosphorylation et d'O-GlcNAcylation établis grâce à nos investigations par spectroscopie RMN ont contribué à une description site-spécifique et quantitative de ces MPT, et de leur dialogue à l'échelle du résidu (Smet-Nocca et al, Mol BioSyst 2011 ; Bourré et al, Front Endocrinol 2018 ; Cantrelle et al, Front Mol Neurosci 2021).
Les profils de phosphorylation obtenus in vitro par des kinases pertinentes dans la pathologie (PKA, CDK2/cycline A, GSK3, ERK2) ou l'activité kinase d'extraits de cerveaux de rats ont permis d'obtenir des formes hyperphosphorylées de Tau, regroupant plusieurs phospho-épitopes spécifiques à la MA. Nous avons notamment montré qu'une courte séquence autour du phospho-épitope AT8 (pS202/pT205 ou AT8-2P) subit un changement conformationnel lorsqu'elle contient un site de phosphorylation supplémentaire en S208 (pS202/pT205/pS208 ou AT8-3P). Alors que la double phosphorylation de l'épitope AT8 de Tau empêche l'agrégation en se repliant selon une structure en coude , l'état de triple phosphorylation déstabilise cette conformation et déclenche l'agrégation en fibrilles de type amyloïde (Despres et al, PNAS 2017). Nos études combinant les approches par RMN, RPE et des tests fonctionnels ont permis de préciser l'impact de ces profils différentiels de phosphorylation d'AT8 sur la conformation de Tau, sa liaison aux microtubules, et sa fonction de polymérisation de la tubuline.
Avec une approche similaire, nous avons caractérisé le profil d'O-GlcNAcylation de la protéine Tau par l'OGT recombinante. Nous avons identifié trois sites d'O-GlcNAcylation majoritaires (S400, S412, S413) dans la région C-terminale de Tau ainsi que d'autres sites dans la région riche en prolines qui présentent des taux de modification significativement plus faibles. Nous avons ensuite évalué l'impact de l'O-GlcNAcylation sur la phosphorylation de Tau et les mécanismes pathologiques d'agrégation. Ainsi, nous avons montré que l'O-GlcNAcylation en S400 modifie la conformation localement autour de l'épitope PHF-1 en combinaison avec la phosphorylation de S404. De plus, l'O-GlcNAcylation diminue la vitesse d'agrégation et la formation des fibres impliquant les formes phosphorylées de Tau. Ces fibrilles présentent des ultrastructures semblables aux PHF (PHF-like) dans un modèle d'agrégation en solution.
En parallèle, nos études concernant l'agrégation de Tau nous ont amenés à mettre au point un modèle de seeding de l'agrégation en solution faisant intervenir des fragments de Tau, phosphorylés ou non, comprenant la région formant le coeur des fibres amyloïdes. Ces seeds', comprenant diverses formes de Tau allant des oligomères solubles aux fibres insolubles de type PHF-like, sont capables de déclencher l'agrégation de protéines Tau entières. L'optimisation des séquences des fragments et des conditions expérimentales nous permet désormais de produire des seeds de Tau en l'absence d'inducteur externe, qui pourront induire la pathologie Tau dans des modèles neuronaux.
Pour l'étude des mécanismes de propagation de neurone à neurone et de seeding de l'agrégation de Tau, nous avons établis un modèle in vitro basé sur la culture de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans des systèmes microfluidiques. Ces derniers présentent l'avantage de compartimenter les corps cellulaires dans des chambres pré- et post-synaptiques, et d'isoler les synapses dans des microcanaux qui séparent les deux chambres. Les neurones dérivés d'iPSC (iN), issus de lignées Tau-/-, sont transduits avec des vecteurs lentiviraux induisant l'expression de l'isoforme 2N4R de Tau (sauvage ou des variants mutés) fusionnée à des protéines fluorescentes pour la détection. Ainsi, d'après nos données préliminaires, il nous est possible d'observer à la fois la propagation de Tau d'un compartiment cellulaire à l'autre via les synapses, et la formation d'agrégats intracellulaires. Ce modèle sera adapté à la co-expression de Tau avec différentes constructions nanobody-OGT ciblant différentes régions de Tau, afin d'évaluer une augmentation sélective des niveaux d'O-GlcNAcylation de Tau et son impact sur la propagation et le seeding. Il est également possible, au sein des systèmes microfluidiques, de mettre les neurones en présence de protéines chimères nanobody-OGT, produites de manière recombinante, pour observer l'effet de ces composés au sein de la chambre synaptique, sur la propagation et le seeding de Tau.

Le projet de thèse se propose d'augmenter sélectivement l'O-GlcNAcylation de la protéine Tau dans des neurones dérivés d'iPSC (iNs) afin d'évaluer son effet sur la modulation des mécanismes liés à la pathologie Tau. Pour cela, nous allons produire et caractériser différentes constructions nanobody-OGT. Les nanobodies (ou VHHs) dirigés contre la protéine Tau sont fusionnés au domaine catalytique O-GlcNAc transférase de l'OGT pour augmenter sélectivement les niveaux d'O-GlcNAcylation de Tau. L'objectif est de caractériser les profils d'O-GlcNAcylation spécifiques obtenus avec les différentes constructions nanobody-OGT qui ciblent différentes régions fonctionnelles de la protéine Tau. Une co-expression de Tau (isoforme 2N4R) et des nanobody-OGT dans les iNs permettra de définir le rôle de l'O-GlcNAcylation sur la phosphorylation et la fonction pathologique de la protéine Tau (propagation et seeding des formes pathologiques).

Le projet de recherche comporte plusieurs volets méthodologiques. Des données préliminaires sont disponibles pour chaque aspect méthodologique impliqué dans le projet.

1.Production recombinante des nanobody-OGT et activité O-GlcNAc transférase
Dans un premier volet, le projet est basé sur la production recombinante des différentes constructions nanobody-OGT. Des étapes d'optimisation ont permis d'améliorer les rendements obtenus et les niveaux de pureté. En parallèle, ce volet comporte la production des protéines Tau (sauvage, fragments, mutants) et des enzymes de modifications (OGT et kinases). Diverses méthodes biophysiques (spectroscopie RMN et spectrométrie de masse) et biochimiques (western blot, marquage chemo-enzymatique) permettront d'établir les profils d'O-GlcNAcylation sur la base des expériences déjà réalisées avec l'OGT native. L'effet des profils d'O-GlcNAcylation sur les profils de phosphorylation par diverses kinases purifiées pourra être obtenu selon les méthodes développées au sein de l'équipe.
Ce volet du projet est basé sur une méthodologie et une instrumentation de spectroscopie RMN de pointe, accessible sous forme de projets (Infranalytics - CNRS FR2054 ; par exemple, à l'Université de Lille, RMN à 900 MHz et projet CPER RMN 1.2 GHz). Les analyses des profils de MPT par spectrométrie de masse sont sous-traitées à une plateforme (SFR Biosciences, PSF, Lyon). La combinaison de ces méthodes biophysiques, de biochimie et de chimie-biologie s'est avérée fructueuse comme en témoignent les publications antérieures, qui montrent l'expertise de l'équipe et de ses collaborations dans le domaine de recherche proposé.

2.Caractérisation des fonctions physiopathologiques des protéines Tau O-GlcNAcylées
Nous allons ensuite définir l'impact des profils d'O-GlcNAcylation au niveau fonctionnel : (i) sur la liaison aux microtubules et la tubuline, (ii) sur la polymérisation de la tubuline (i et ii dans le cadre d'une collaboration avec la Pr Pascale Barbier, Univ. Aix-Marseille UMR 7051), (iii) sur la capacité de Tau à former des fibres ou des espèces toxiques impliquées dans la propagation de la pathologie, et (iv) sur la capacité d'agrégation dans un modèle de seeding en solution, induit par des fibres de Tau préformées.

3.Effet des nanobody-OGT sur la propagation de Tau de neurone à neurone et le seeding
Au cours de la thèse doctorale de M. Bruno Queiros (en cours, 3e année), nous avons mis au point au laboratoire un modèle de culture de neurones dérivés d'iPSC en système microfluidique. Ces derniers présentent l'avantage de séparer les neurones pré- et post-synaptiques dans des chambres de culture distinctes reliées par des microcanaux dans lesquels passent les axones, offrant une vue détaillée du transfert des protéines. Ces neurones dérivés d'iPSC (iN) sont issus d'une lignée Tau-/- ce qui permet d'observer uniquement la protéine Tau transduite via des vecteurs lentiviraux dans le compartiment souhaité. Nous disposons de différents vecteurs pour l'expression de l'isoforme 2N4R de Tau, dans sa forme sauvage ou sous forme mutée (mutation P301L pro-agrégative associée aux démences fronto-temporales, mutation de différents phospho-épitopes associés aux tauopathies).
Les protéines Tau sont détectées par immunofluorescence ou en 'live imaging' via la fusion de protéines fluorescentes. La GFP est utilisée pour la détection de la propagation de Tau. Dans ce cas, les neurones sont transduits dans la chambre pré-synaptique. La protéine Vénus, dérivée de la protéine YFP, est utilisée en complémentation bimoléculaire de fluorescence (BiFC) pour la détection de formes agrégées de Tau après transduction des chambres pré- et post-synaptiques avec les formes N-terminale (VN) et C-terminale (VC) de Vénus, respectivement. Les profils de MPT sont analysés par western blot avec des anticorps ciblant des fragments de Tau (par exemple, forme tronquée en D421), des formes oligomériques (T22 ou TOMA-1), des phosphorylations spécifiques (AT8, PHF-1, AT180...), des formes O-GlcNAcylées en S400. En parallèle, les profils globaux d'O-GlcNAcylation peuvent être obtenus avec les anticorps RL-2 ou CTD110.6. Ce modèle d'iNs en système microfluidique sera adapté à la co-expression de Tau avec les différentes constructions nanobody-OGT. Dans ces systèmes microfluidiques, une troisième chambre connectée aux canaux où passent les axones permet de faire une co-culture des neurones avec un autre type cellulaire (par exemple, les microglies) ou d'exposer les axones/synapses à du milieu conditionné complémenté avec les nanobody-OGT recombinants.