Thèse CD - Effet Protecteur des Cellules Stromales Mésenchymateuses Pro-Inflammatoires sur l'Anergie Immunitaire Ciblant les Lymphocytes t H/F

Université de Lorraine

Établissement : Université de Lorraine
École doctorale : BioSE - Biologie Santé Environnement
Laboratoire de recherche : IMoPA - Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire
Direction de la thèse : Céline HUSELSTEIN ORCID 0000000206394843
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-06-09T23:59:59

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont largement été décrites comme possédant des propriétés immunomodulatrices et immunosuppressives ; c'est pourquoi, elles sont actuellement utilisées dans de nombreux essais cliniques pour des pathologies inflammatoires et auto-immunes. Cependant, des études in vitro et in vivo ont récemment mis en évidence un potentiel pro-inflammatoire et immunoprotecteur des CSM. Ainsi, en cas d'anergie cellulaire, elles seraient en mesure d'adopter un phénotype pro-inflammatoire CSM1 permettant de limiter l'apoptose et de favoriser la survie des lymphocytes T. Ce changement de phénotype selon l'environnement inflammatoire laisse entrevoir de nouvelles opportunités d'utilisations thérapeutiques et plus particulièrement dans des indications où une anergie immunitaire existe. Le projet ProtectMSC a pour objectif d'étudier l'effet protecteur du phénotype CSM1 dans des modèles in vitro d'exhaustion lymphocytaire. L'originalité du projet réside dans : i) la caractérisation fine du profil CSM1 ; ii) l'analyse phénotypique et fonctionnelle de l'impact des CSM1 sur des lymphocytes T rendus anergiques in vitro; iii) l'étude de la plasticité des CSM.

Les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM), ont été décrites pour la première fois par l'équipe de Friedenstein dans les années 70. Observées en premier lieu dans la moelle osseuse (MO) et décrites comme étant des cellules d'aspect fibroblastiques(1), elles ont été par la suite mises en évidence dans de nombreux tissus tels que le tissu adipeux, la pulpe dentaire, le sang menstruel ou encore les annexes foetales comme la gelée de Wharton (GW) ou le placenta. L'hétérogénéité de cette population cellulaire a conduit la société internationale de thérapie cellulaire (International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT)) à en définir les contours. Ainsi, une cellule est considérée comme étant une cellule souche mésenchymateuse si elle est i) adhérente au plastique ii) capable de se différencier en ostéocyte, chondrocyte, adipocyte iii) positive aux marqueurs mésenchymateux (CD90 CD105 CD73) et négative aux marqueurs hématopoïétiques (CD45 CD34 HLADR)(2, 3). Ces cellules multipotentes présentent de nombreux atouts mais leur attrait principal réside dans leurs puissantes capacités immunomodulatrices(4). Elles sont en effet capables de moduler l'immunité innée aussi bien qu'adaptative par contacts cellulaires, sécrétion de cytokines, chémokines, facteurs de croissance, vésicules extracellulaires mais également par transfert mitochondrial. Sur l'immunité adaptative, elles sont en mesure de diminuer la cytotoxicité de lymphocytes T, bloquer leur prolifération mais également leur activation en inhibant la maturation des cellules dendritiques. Dans un contexte inflammatoire, elles inhibent la prolifération des lymphocytes B ainsi que leur production d'immunoglobulines. Sur l'immunité innée, elles diminuent notamment la production d'espèces réactives de l'oxygène par les neutrophiles et favorisent le phénotype M2 anti-inflammatoire des macrophages(5). Ainsi, elles influencent le phénotype des cellules immunitaires et leurs sécrétions cytokiniques.

Cependant cette immunomodulation serait différente selon le contexte inflammatoire. En 2013, Bernardo et Fibbe décrivent l'existence d'un double phénotype de CSM immunosuppresseur ou immunostimulant, dépendant de la stimulation de leur TLR et du contexte inflammatoire(6), à l'image des macrophages. En cas d'anergie cellulaire, elles seraient en mesure d'adopter un phénotype pro-inflammatoire CSM1 permettant de limiter l'apoptose et de favoriser la survie des lymphocytes T(7). A l'inverse, en cas de faible inflammation, elles adopteraient un phénotype immunosuppresseur et anti-inflammatoire, dit CSM2 (Figure 1). L'existence de ce double phénotype, confirmé depuis par plusieurs études in vitro(7-10), semble également être présent in vivo, les résultats d'essais cliniques d'administration de CSM dans la COVID-19 mettant en évidence une protection des lymphocytes T de l'anergie cellulaire(11).
Ce changement de phénotype selon l'environnement inflammatoire laisse entrevoir de nouvelles opportunités d'utilisations thérapeutiques, dans des indications où l'exhaustion immunitaire est une composante physiopathologique importante telles que le sepsis et le choc septique. En effet, la physiopathologie extrêmement complexe de ce syndrome, entrelaçant un état pro-inflammatoire et anti-inflammatoire, rend caduque l'action des thérapeutiques conventionnelles(12). Outre la présence concomitante de cytokines pro et anti-inflammatoires, il a été mis en évidence une immunoparalysie associée au choc à l'origine des décès tardifs. Plusieurs études ont démontré l'impact négatif du sepsis sur les lymphocytes T dont le nombre semble décroître avec sa gravité. En effet, le sepsis engendrerait une cruelle diminution du nombre de lymphocytes T CD4 et CD8 mémoires et une altération de leur sécrétion cytokinique, concourant à augmenter la susceptibilité du patient à développer des infections secondaires(13).

Différentes sous-populations sont distinguées au sein des lymphocytes T CD4 ou CD8 : les T effecteurs (TEFF), les T mémoires effecteurs (TEM), les T centraux mémoires (TCM) les T naïfs (TN), et les T souches centraux mémoires (TSCM)13. Cette dernière est essentielle au contrôle d'une infection chronique. Lors d'une infection, le réservoir des TEFF s'épuise rapidement et nécessite d'être renouvelé via la différenciation des lymphocytes T mémoires (particulièrement les TSCM, population la plus immature des T mémoires). Le maintien du nombre de T mémoires est donc nécessaire dans la lutte contre les pathogènes.

Peu décrites voire délaissées au profit des CSM2, les CSM1 pourraient pourtant s'avérer bénéfiques dans les dysimmunités où l'anergie cellulaire prédomine. Ainsi, nous souhaitons étudier plus spécifiquement le phénotype CSM1 afin d'en envisager l'utilisation dans des indications telles que le sepsis et choc septique.

Ce projet de thèse s'inscrira dans l'ANR PRCE ESSENTIEL visant à proposer la mise au point d'un Médicament de Thérapie Innovante (MTI), constitué de CSM(GW) préconditionnées pouvant moduler l'immunoparalysie associée au sepsis. La/le candidat.e poursuivra les travaux de thèse de Mme Théa Pignot (soutenance prévue en Mail 2026). Au cours de son doctorat, Mme Théa Pignot a étudié différentes molécules de pré-conditionnement permettant d'orienter in vitro des CSM vers un phénotype pro ou anti-inflammatoire. Les molécules de stimulations utilisées ont été : le Lipopolysacharride (LPS) ou le Resiquimod (R848) pour obtenir CSM1 et l'acide polyinosinique-polycytidyliquee (Poly I :C) ou l'association Interféron et Facteur de Nécrose Tumorale (IFNTNF) pour obtenir CSM2. Ces molécules à l'exception de l'IFNTNF correspondent aux ligands de TLR utilisés par les cellules pour détecter des signaux de dangers de type PAMPs (Pathogens Associated Molecules Patterns) et déclencher une réponse immunitaire. Dans son projet, après préconditionnement, les CSM de gelée de Wharton ont été caractérisées sur le plan phénotypique, mécanistique et fonctionnel afin d'évaluer l'efficacité du préconditionnement choisi et de mieux caractériser le profil immunitaire obtenu.
Mme Pignot a pu montrer que les CSM, préconditionnées ou non préconditionnées, étaient en mesure de diminuer la prolifération de LT activés. En revanche, au contact de LT rendus anergiques in vitro (par l'utilisation de méthylprednisolone seule ou combinée avec du LPS) puis activés, les CSM, qu'elles soient CSM1 ou CSM2 ou non préconditionnées, n'étaient plus immunosuppressives et n'étaient plus capables d'inhiber la prolifération des LT.
Les travaux de thèse de Mme Théa Pignot ont également pu mettre en évidence que les CSM étudiées présentaient simultanément des propriétés pro et anti inflammatoires mais n'ont pas pu déterminer si ces propriétés étaient la conséquence d'une hétérogénéité cellulaire après préconditionnement, avec la présence de cellules CSM1 et de cellules CSM2, ou si intrinsèquement les CSM étaient à la fois CSM1 et CSM2. De même, nous n'avons pas pu explorer les fonctionnalités des lymphocytes T après coculture avec des CSM précondtionnées. Enfin, de nouvelles interrogations émergent à partir de ce travail telle que la capacité des CSM à pouvoir changer plusieurs fois de phénotype.

Ce projet de thèse permettra alors
de caractériser le.s phénotype.s cellulaire.s obtenu.s après préconditionnement des CSM,
(ii) d'évaluer l'action des CSM préconditionnées sur la fonctionnalité de lymphocytes T exhaustés,
(iii) d'évaluer la plasticité des CSM préconditionnées.

Ce projet de thèse aura pour objectif d'étudier l'effet protecteur des CSM pro-inflammatoires sur l'anergie immunitaire ciblant les lymphocytes T.

Objectif 1 : Caractérisation des CSM1
A)Production des CSM1
Les CSM seront isolées de la gelée de Wharton du cordon ombilical selon la méthode des explants. Les cordons ombilicaux seront collectés, dans le cadre de l'ANR ESSENTIEL, à la Maternité du CHRU de Nancy après information et consentement des mères donneuses.
Les CSM seront cultivées jusqu'au passage 3 et préconditionnées avant congélation selon le protocole mis en place par Théa Pignot durant sa thèse. Deux pré-conditionnements seront utilisés : le LPS et l'IFNTNF. Si ce dernier est classiquement utilisé pour obtenir un phénotype de CSM immunosuppresseur, nous avons pu mettre en évidence qu'il induisait une augmentation de la sécrétion de chimiokines et cytokines pro-inflammatoires et une augmentation des molécules de co-stimulation des LT, laissant suggérer une ambivalence phénotypique pouvant conduire à un profil CSM1 (Article soumis dans Stem cells research and therapy).

B) Analyse du métabolisme cellulaire
L'analyse de l'activité métabolique des CSM préconditionnées ou non permettra d'évaluer si le préconditionnement biochimique modifie l'activité mitochondriale et le métabolisme énergétique des cellules. Cette analyse sera effectuée à l'aide de l'analyseur de flux extracellulaire Seahorse (Agilent Technologies) pour obtenir les informations fonctionnelles sur l'état métabolique des CSM en distinguant les métabolismes aérobie (OCR (Oxygen Consumption Rate)) et glycolytique (Glycolysis Stress Test).

Analyse de la respiration mitochondriale
Les CSM seront lavées et incubées dans un milieu de base DMEM XF Seahorse (Agilent) supplémenté en glucose, pyruvate de sodium et L-glutamine puis incubées 45 minutes à 37 °C sans CO avant la mesure.
Les taux de consommation d'oxygène seront mesurés dans des conditions basales et après ajout d'oligomycine (inhibiteur de l'ATP synthase) et de FCCP (découplant de la phosphorylation oxydative). L'oligomycine inhibe la production d'ATP par les mitochondries, entraînant une augmentation compensatoire du taux de glycolyse. Le FCCP dépolarise la membrane mitochondriale, ce qui augmente le taux de consommation d'oxygène, les mitochondries tentant de rétablir leur potentiel membranaire.

Analyse glycolytique
Pour l'évaluation de la glycolyse, les cellules seront incubées dans du milieu XF Base sans glucose, supplémenté uniquement avec de la glutamine. Les taux d'acidification extracellulaire seront mesurés au cours du temps dans des conditions basales et après ajout de Glucose, d'Oligomycine, de 2-Désoxy-D-glucose permettant d'évaluer la glycolyse basale, la capacité glycolytique, la réserve glycolytique et l'acidification non glycolytique.

C) Analyse des sous populations cellulaires au sein des CSM préconditionnées
L'hétérogénéité des CSM obtenues après préconditionnement sera évaluée par combinaison de «single cell» et de transcriptomique (« single cell RNA-seq ») en utilisant les compétences de l'UMS IBSLor ainsi celles du plateau technique bioinformatique / biostatistiques pour l'analyse bioinformatique.

Objectif 2 : Etude de l'impact des CSM1 sur la fonctionnalité des lymphocytes T dans un contexte d'exhaustion ou d'immunosuppression.

A.Étude des sous populations lymphocytaires
Afin d'étudier l'impact des CSM sur les sous-populations lymphocytaires T, des cellules mononucléées, préalablement isolées par gradient de densité, seront amplifiées en présence d'IL-2, IL-7 et IL-15. Ce cocktail cytokinique permettra la prolifération et l'amplification des cellules T les plus immatures.
Une fois amplifiés, les lymphocytes T seront :
-incubés avec le méthylprednisolone, un anti-inflammatoire stéroïdien puissant permettant de mimer un contexte d'immunosuppression,
ou
-épuisés par des cycles de stimulation répétées, via des anticorps anti-CD3-CD28 couplés à des billes, permettant de mimer une exhaustion.

L'efficacité de l'anergie/exhaustion des LT sera évaluée par l'analyse, en cytométrie en flux, de la prolifération et de l'apoptose des cellules ainsi que l'expression des différents marqueurs d'épuisement (PD-1, CTLA-4, TIM3, TIGIT et LAG3), de dégranulation (CD107a). La sécrétion d'IL2 et IFNg sera également dosée par ELISA.
L'effet protecteur des CSM pré-conditionnées ou non avec de lFNTNF ou du LPS dans un contexte d'exhaustion immunitaire sera ensuite étudié à travers l'évolution d'expression des différents marqueurs précédemment cités.

Les sous-populations lymphocytaires seront analysées par cytométrie en flux avant et après ajout de CSM. Pour ce faire, les sous-populations lymphocytaires seront identifiées selon l'expression des marqueurs CCR7, CD45RA, CD95, CD62L.

B.Étude de cytotoxicité
Des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques de l'adénovirus seront isolés par sélection immunomagnétique conformément au procédé de production de l'Unité de thérapie cellulaire et banque de tissus du CHRU. Les CTL anti viraux seront incubés avec la méthylprednisolone ou épuisés par des cycles de stimulation répétées puis co-cultivés avec des CSM préconditionnées ou non. A la fin de la co-culture, les CTL anti-viraux seront récupérés et un test de cytotoxicité face à des cellules autologues présentant leur cible antigénique (pool de peptide du virus concerné, Peptivator Miltenyi) sera réalisé.

C.Étude de la sécrétion de cytokines et perforines
Des LT préalablement isolés par technique immunomagnétique, issus de donneurs sains, seront incubés avec la méthylprednisolone ou épuisés par des cycles de stimulation répétées puis co-cultivés avec des CSM préconditionnées ou non. A la fin de la co-culture, seront récupérés :
-Les lymphocytes T après centrifugation des surnageants afin d'analyser la sécrétion d'IL2 et IFN intracellulaire par cytométrie en flux.
-les surnageants afin d'analyser la sécrétion de cytokines et chimiokines par multiplex. Le kit Millipore MILLIPLEX MAP Human CD8+ T Cell permettra d'évaluer par technique Luminex, la fonction des lymphocytes T CD8 en dosant dans le surnageant GM-CSF, sCD137, IFN, sFas, sFasL, Granzyme A, Granzyme B, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, MIP-1, MIP-1, TNF-, Perforin.

Objectif 3 Etude de la plasticité du phénotype CSM1
A l'issue de l'objectif 2, seul le précondtionnement permettant de restaurer/protéger au mieux les fonctionnalités des lymphocytes T de l'exhaustion sera conservé.

A.Etude du comportement des CSM1 face à un pool hétérogène de lymphocytes T
Des CSM précondtionnées ou non, seront mises en coculture avec un pool de lymphocytes T d'un même donneur constitué de cellules en exhaustion et des cellules non épuisées.
Pour ce faire, des CMN issues de donneurs sains seront isolées par gradient de densité. Les lymphocytes T seront isolés par sélection immunomagnétique puis séparés en deux conditions de culture : (i) en présence d'IL2 seule (ii) en présence d'IL2 et avec 3 cycles d'activation par stimulation CD3/CD28 permettant d'obtenir l'exhaustion des lymphocytes T. Les lymphocytes T non épuisés seront marqués au CellTrace Violet et les lymphocytes T en exhaustion au CellTrace Red. Ce marquage permettra de distinguer les deux populations. Les lymphocytes T seront ensuite poolés et mis en co-culture avec des CSM, préconditionnées ou non. Enfin une activation CD3/CD28 des lymphocytes T sera réalisée. Le surnageant comprenant les lymphocytes T sera récupéré afin d'analyser, la prolifération des LT, les marqueurs d'exhaustion (TIGIT LAG3 PD1), la sécrétion d'IL2 intracellulaire, et la présence de mitochondries issues des CSM, par cytométrie en flux. Le même protocole sera appliqué avec des lymphocytes T rendus anergiques par la methylprednisolone.

B.Etude de la réversion phénotypique
Après avoir étudié le comportement des CSM face à un pool de lymphocytes T, nous nous intéresserons au potentiel d'action des CSM soumises à deux contextes lymphocytaires différents (LT activés ou épuisés) séparés dans le temps.
Pour ce faire, des CMN issues de donneurs sains seront isolées par gradient de densité. Les lymphocytes T, isolés par sélection immunomagnétique, seront cultivés en présence d'IL2 et subiront 3 cycles d'activation par stimulation CD3/CD28, permettant d'induire leur exhaustion. Les lymphocytes T épuisés seront mis en co-culture avec des CSM, précontionnées ou non. Enfin une activation CD3/CD28 des lymphocytes T sera réalisée. Le surnageant comprenant les lymphocytes T sera récupéré afin d'analyser, la prolifération des LT, les marqueurs d'exhaustion (TIGIT LAG3 PD1), la sécrétion d'IL2 intracellulaire, et la présence de mitochondrie issues des CSM par cytométrie en flux.
Les CSM issues de cette première co-culture, seront remises en coculture avec des lymphocytes T, cette fois-ci non épuisés et activés. Le potentiel des CSM à devenir CSM2 après avoir été CSM1, sera évaluée par leur capacité à inhiber la prolifération des lymphocytes T activés par cytométrie en flux.
Le même protocole sera appliqué d'une part, avec une coculture des CSM et de lymphocytes T activés puis dans un second temps avec des lymphocytes T épuisés (capacité des CSM à être cette fois-ci CSM2 puis CSM1 et d'autre part avec l'induction d'une immunosuppression non pas par exhaustion, mais par methylprednisolone .
A la fin de l'étude A et B de l'objectif 3, les CSM seront trypsinées est qualifiées phénotypiquement selon les marqueurs mis en évidence au cours de la thèse de Théa Pignot (PDL1 CD40 CD86 HLADR) et lors de l'objectif 1C.