Thèse CD - Rôle des Intégrines dans l'Interaction Endothélium-Épithélium au Cours de l'Emphysème H/F Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Lorraine École doctorale : BioSE - Biologie Santé Environnement Laboratoire de recherche : DCAC - Défaillance cardiovasculaire aigue et chronique Direction de la thèse : Ari CHAOUAT ORCID 000000016056202X Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-10-31T23:59:59 La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est causée par des anomalies persistantes et hétérogènes des voies respiratoires distales (bronchite, bronchiolite), des alvéoles (emphysème) et des vaisseaux pulmonaires (hypertension pulmonaire). Le principal facteur étiologique est le tabagisme. Au niveau cellulaire, les principales cellules progénitrices alvéolaires sont les pneumocytes de type 2. En association avec les pneumocytes, les cellules mésenchymateuses et endothéliales forment la barrière alvéolo-capillaire. L'implication des cellules endothéliales pulmonaires des artérioles pulmonaires précapillaires et des capillaires pulmonaires dans la genèse de l'emphysème est suspectée. Ces cellules endothéliales pulmonaires possèdent des récepteurs transmembranaires, nommés intégrines, impliqués dans la signalisation intercellulaire. Les interactions entre les cellules endothéliales et épithéliales alvéolaires dans l'emphysème sont peu étudiées. Le rôle précis des intégrines dont une intégrine majeure v3 dans ce contexte n'est pas connu. Nous émettons l'hypothèse que la genèse de l'emphysème pulmonaire est, au moins en partie, liée à une altération de la communication intercellulaire entre les cellules endothéliales et épithéliales progénitrices alvéolaires via une dérégulation de l'intégrine v3. L'objectif est de comparer la capacité de formation de sphéroïdes alvéolaires en présence de cellules endothéliales pulmonaires présentant un niveau d'expression différent de l'intégrine v3 provenant de patients fumeurs avec emphysème, fumeurs sans emphysème et non-fumeurs. Nous nous attendons à mettre en évidence une diminution de l'expression d'v3 chez les patients fumeurs et emphysémateux. Le nombre de sphéroïdes formées serait diminué en cas de co-culture avec des cellules endothéliales présentant une diminution d'v3. Les maladies respiratoires chroniques ont un impact majeur en santé publique avec plus de 250 millions de personnes atteintes par ces pathologies et une survie à 5 ans de 50% dans les stades les plus sévères de la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO). La BPCO est principalement secondaire à une exposition à la fumée de tabac et évolue vers le stade d'insuffisance respiratoire chronique. Dans cette pathologie, la destruction du parenchyme pulmonaire au niveau alvéolaire est nommée emphysème pulmonaire. La présence d'emphysème est un facteur de mauvais pronostic dans la BPCO car une fois établi, il n'existe aucun traitement permettant la régénération du tissu pulmonaire.
L'un des mécanismes physiopathologiques décrit dans la BPCO et dans l'atteinte emphysémateuse est une possible origine par une atteinte vasculaire pulmonaire précoce (1). En effet, la structure des alvéoles pulmonaires correspond à un feuillet de cellules épithéliales composé de pneumocytes de type 2 (P2), considérés comme la cellule souche alvéolaire qui prolifère et se différencie en pneumocytes de type 1 (P1) qui tapissent la surface des alvéoles pulmonaires (2). La différenciation des P2 en P1 est sous le contrôle des cellules qui composent la niche de cellules souches alvéolaires (stem cell niche) : les cellules mésenchymateuses et endothéliales (Figure 1). Les caractéristiques et interactions de l'ensemble des cellules de cette niche de cellules souches sont bien décrits pour l'interaction mésenchymato-épithéliale durant la croissance pulmonaire (3), dans les poumons normaux (4,5) ou durant la fibrose pulmonaire (6,7). La compréhension de l'interaction endothélium-épithélium est moins bien comprise, en particulier dans un contexte d'emphysème pulmonaire. La microvascularisation pulmonaire est constituée de deux sous-populations endothéliales complémentaires : les aerocytes (aCap), hautement spécialisées dans les échanges gazeux au contact des pneumocytes de type I, et les cellules capillaires générales (gCap), plus plastiques et dotées d'un potentiel régénératif, capables de donner naissance à des aerocytes lors des processus de réparation ou de remodelage alvéolaire (8).
Les intégrines sont des protéines transmembranaires interagissant avec les protéines de la matrice extracellulaire en dehors de la cellule d'un côté et avec les composants intracellulaires de l'autre permettant un contrôle de la migration, la survie, la prolifération et la différenciation cellulaire. Les intégrines sont composées de sous unités alpha et beta (24 combinaisons au total). Au niveau endothélial pulmonaire, les intégrines 11, 21, 51 et v3 sont particulièrement exprimées (9). Dans des conditions stables, il a été montré que l'hétérodimère v3 est exprimé de façon large par les capillaires pulmonaires. Elle est l'intégrine la plus largement exprimée dans la vascularisation pulmonaire alors qu'elle est faiblement exprimée au niveau vasculaire d'autres organes (10). Les souris déficientes en intégrine 3 présentent une perméabilité vasculaire accrue lors d'infections (11) et les antagonistes de v3 inhibent la prolifération endothéliale et donc la vascularisation. La sous unité v est particulièrement exprimée au sein des gCap après analyse du « Lung endothelial cell atlas » (figure 2).
Plusieurs intégrines jouent un rôle dans le maintien de l'intégrité pulmonaire, avec par exemple l'apparition d'emphysème en cas de délétion de l'intégrine 1 ou 6 (12,13).
Le rôle de l'intégrine v3 au sein des cellules endothéliales dans l'emphysème pulmonaire n'est pas connu et il est possible que la délétion de cette intégrine entraine de l'emphysème ou facilite l'apparition d'emphysème pulmonaire en cas d'agression par le tabagisme. Les mécanismes d'apparition de l'emphysème pulmonaire pourraient donc impliquer des altérations dans la communication intercellulaire entre l'endothélium et l'épithélium via cette intégrine.
L'importance des interactions endothélium-épithélium alvéolaire a été décrite sur des modèles d'organoïdes montrant un lien positif entre la formation d'organoïdes alvéolaires et la présence de cellules endothéliales (Figure 3), tandis que l'exposition à la fumée de cigarette diminue la formation de ces organoïdes (14). Ces résultats suggèrent une réduction de la régénération alvéolaire due au tabagisme et soutiennent une interaction positive paracrine entre l'endothélium et l'épithélium pour maintenir l'intégrité du parenchyme pulmonaire au niveau des alvéoles (15). Cette étude vise à élucider la contribution potentielle de l'intégrine v3, exprimée par les cellules endothéliales pulmonaires, à la physiopathologie de l'emphysème et à ses capacités de réparation tissulaire.
Nous confirmerons d'abord, chez l'humain, que les intégrines sont modulées dans les zones emphysémateuses en comparant leur expression endothéliale à celle observée dans les zones pulmonaires préservées. Les cellules endothéliales issues de régions emphysémateuses seront ensuite isolées, triées afin d'identifier les sous-populations exprimant les intégrines, notamment v3 et mises en culture. La prolifération sera étudiée et l'inhibition de l'intégrine v3 devrait réduire la prolifération endothéliale et modifier le profil du sécrétome. En parallèle, l'activation de l'intégrine v3 permettra d'évaluer son rôle fonctionnel, une augmentation de la prolifération étant attendue. Enfin, les voies de signalisation en aval, en particulier la voie VEGF et son interaction avec v3, seront explorées afin de mieux comprendre les mécanismes reliant l'activation des intégrines à la possible réparation microvasculaire dans l'emphysème.
Pour atteindre cet objectif, une analyse comparative sera réalisée sur trois groupes distincts de patients : des individus non-fumeurs (groupe témoin), des fumeurs sans emphysème et des fumeurs atteints d'emphysème. Le statut emphysémateux sera évalué à partir de l'imagerie thoracique, à l'aide d'une quantification précise permettant de classer chaque patient selon des critères objectifs et standardisés.
Les paramètres suivants seront donc évalués :
- Le niveau d'expression de l'intégrine v3 dans les cellules endothéliales sur des coupes de poumon humain provenant des trois groupes de patients.
- La prolifération des cellules endothéliales en culture primaire en fonction de la présence ou non d'v3, et après mise en place de modèles d'inhibition ou d'activation de cette intégrine.
- L'impact de la fumée de cigarette sur la modulation de l'expression de l'intégrine v3 dans les cellules endothéliales.
- L'effet de cellules endothéliales présentant des niveaux d'expression variables d'v3 sur des cultures tridimensionnelles d'organoïdes alvéolaires.
Lieu de réalisation
Ce travail sera réalisé au sein de l'unité INSERM 1116 DCAC (Défaillance cardiovasculaire aigue et chronique) au sein de l'université de Lorraine. Les méthodes de cultures cellulaires monocouche, immunofluorescence, tri en cytométrie en flux et de réalisation des organoïdes sont acquises par l'encadrant Dr Ribeiro Baptista (DOI :10.1101/2025.09.05.674489).
Cadre réglementaire et éthique
Le projet est considéré comme une recherche multicentrique n'entrant pas dans le champ des recherches impliquant la personne humaine (Hors RIPH) et entre dans le champ de la méthodologie de référence MR004 mise en place par la CNIL (Protocole RINE3 : Rôle de l'INtégrine v3 dans l'interaction Endothélium-Épithélium au cours de l'Emphysème). Un avis favorable auprès du comité d'éthique du CHRU de Nancy a été reçu (saisine 539) et un MTA (material transfer agreement) est signé entre le CHRU de Nancy et les instances de l'INSERM.
Caractérisation de l'expression d'v3 dans les cellules endothéliales pulmonaires chez des patients fumeurs, fumeurs atteints d'emphysème et non-fumeurs
Afin de définir le niveau d'expression d'v3 dans les tissus pulmonaires, des échantillons de tissus humains provenant de patients non-fumeurs, fumeurs et emphysémateux seront utilisés. Les patients ayant subi une chirurgie thoracique pour la prise en charge de cancer ou pour une réduction de volume de l'emphysème ont déjà des tissus collectés et stockés dans le service d'anatomopathologie du CHRU de Nancy. Les sections tissulaires issues de zones à distance de la pathologie néoplasique seront utilisées. Les tissus inclus dans la paraffine de manière standard seront récupérés, sans incidence sur les soins aux patients. Un co-marquage en immunofluorescence d'v3 (ab190147, Abcam) au sein des cellules endothéliales (CD31+ Ab28364, Abcam) sera réalisé avec la possibilité de distinguer les aCap et les gCap par marquage anti-HPGD et Anti-Periaxin, respectivement. Nous prévoyons de démontrer une diminution de cette intégrine au sein des cellules endothéliales chez les patients fumeurs et cette diminution serait plus marquée en cas de lésions d'emphysème pulmonaire.
Étude de la prolifération des cellules endothéliales
Les cellules endothéliales seront obtenues grâce à une collaboration avec les départements de chirurgie thoracique du CHRU de Nancy, dans le cadre du protocole RINE3. Une partie des tissus pulmonaires des patients subissant une chirurgie thoracique programmée sera prélevée (à distance des nodules pulmonaires, le cas échéant) et placée dans un milieu de culture afin de maintenir la viabilité cellulaire. L'utilisation de ce tissu ne nécessitera aucune modification des pratiques chirurgicales : seuls les fragments non utilisés pour la prise en charge clinique seront dédiés à la recherche.
L'échantillon de poumon humain sera découpé en petits fragments, après retrait autant que possible de la plèvre et des voies aériennes. L'échantillon sera ensuite incubé dans une solution de digestion (collagénase type I : 450 U/mL, dispase : 5 U/mL, DNase I : 10 U/mL) pendant une heure sous agitation (Octodissociator, Miltenyi). Après plusieurs étapes de filtration et de lyse des globules rouges (ACK Lysis, Thermofischer), les cellules seront triées par cytométrie en flux afin d'exclure les cellules EpCAM et CD45, et de conserver les cellules CD31, représentatives de la population endothéliale.
L'une des limites de cette approche est l'utilisation de cellules endothéliales au sens large sans possibilité de trier précisément les sous-populations aCap et gCap. Aucun marqueur de surface exclusif et aisément exploitable en cytométrie ne permet encore de les différencier. De plus, plusieurs sous-clusters de gCap ont été décrits en single-cell RNA-seq (16), mais leur étude individuelle serait complexe. Nous faisons l'hypothèse que la population gCap, plus proliférative et régénérative, sera majoritairement représentée, car plus facilement cultivable et identifiable in vitro, tandis que la population aCap, plus différenciée, est plus fragile. La réalisation d'un marquage sur Labtek des aCap (anti-HPGD, sc-271418, Santa Cruz) et gCap (Anti-Periaxin, NBP1-89598, Novus Bio) permettra d'évaluer la proportion de ces différentes populations.
Deux populations distinctes de cellules endothéliales CD31 seront isolées : CD31highv3high et CD31highv3low (Figure 4). La culture de ces deux groupes permettra d'évaluer d'éventuelles différences de prolifération (analyse du population doubling level et du marqueur Ki-67). Nous anticipons une prolifération cellulaire plus importante au sein de la population CD31highv3high.
Afin de confirmer le rôle de cette intégrine dans les mécanismes de prolifération, nous proposerons d'activer ou d'inhiber v3 par différentes approches. L'activation sera réalisée à l'aide de peptides RGD en présence de fibronectine, tandis que l'inhibition se fera par voie pharmacologique (Cilengitide, inhibiteur général des intégrines v3/v5) et par siRNA spécifique.
Dans l'ensemble de ces cultures (avec et sans agent pharmacologique), les cellules seront recueillies pour l'étude des mécanismes pouvant expliquer les variations de prolifération. Les principales voies explorées seront : FAK-Src (migration et survie endothéliale), PI3K-AKT-mTOR (survie et prolifération), MAPK/ERK (signalisation du complexe v3-VEGFR2), YAP/TAZ, TGF-, VEGF/VEGFR2 (survie endothéliale et perméabilité) et Wnt/-caténine.
L'analyse du sécrétome du surnageant des cellules endothéliales par Luminex (Plateforme Henry Mondor, Créteil) permettra d'analyser les voies candidates pouvant être augmentées secondairement à l'activation de l'intégrine d'intérêt (VEGF, TGF-, FGF, CXCL12...).
Évaluation de l'impact de la fumée de cigarette sur l'intégrine v3 au sein des cellules endothéliales
L'impact de la fumée de cigarette sur la modulation et l'expression de l'intégrine v3 sera également étudié. La fumée de cigarette est connue pour altérer la fonction endothéliale en induisant l'apoptose et en perturbant l'angiogenèse (17). Certaines voies associées à l'intégrine, en particulier VEGF/VEGFR2, sont fortement affectées, renforçant l'intérêt d'évaluer l'effet du tabac selon le niveau d'expression de notre intégrine d'intérêt. Nous utiliserons la culture en monocouche de cellules endothéliales primaires exposées à un extrait de fumée de cigarette (Cigarette Smoke extract, CSE). Grâce à cette culture, nous étudierons l'expression des intégrines à l'aide de techniques d'immunofluorescence et de western blot en présence ou non de CSE. Une diminution de cette intégrine et des voies de signalisation liées est attendue. Le niveau de dédoublement des populations (PDL) sera quantifié avec ou sans CSE.
Évaluation de la capacité des cellules endothéliales humaines à induire des alvéolosphères en fonction de l'expression d'v3
Pour définir le rôle des cellules endothéliales exprimant v3 dans l'interaction endothélium-épithélium, nous réaliserons des co-cultures de pneumocyte de type 2 sous forme de sphéroïdes avec des cellules endothéliales exprimant fortement v3 et des cellules endothéliales avec expression faible d'v3 préalablement triées.
- Isolement des P2 et formation des sphéroïdes

Pour obtenir des sphéroïdes, la première étape consiste à isoler les P2. Un échantillon de poumon humain récupéré en post opératoire sera découpé en petits morceaux, la plèvre et les voies aériennes étant retirées autant que possible. L'échantillon sera ensuite incubé dans une solution de digestion puis les cellules seront incubées avec l'anticorps HTII-280 de souris IgM (TerraceBiotech), un anticorps spécifique qui se lie aux P2. Un anticorps secondaire anti-IgM de souris couplée à des billes magnétiques sera ensuite utilisé pour permettre un tri magnétique avec la colonne LS (Miltenyi). Cette technique qui consiste à isoler des P2 puis les amplifier après une chirurgie pulmonaire est déjà utilisée par l'équipe de recherche avec laquelle nous collaborons (Pr Laurent Boyer U955, protocole CoStemCells).
Les cellules seront ensuite placées dans une matrice tridimensionnelle pour générer des alvéolosphères dans du Matrigel (Corning) sur une membrane de transwell de 0,4 microns (Corning). Le milieu utilisé pour la culture de ces organoïdes est un milieu sans sérum (SFFF) pour la culture humaine.
Les organoïdes alvéolaires seront co-cultivés avec des cellules endothéliales pulmonaires isolées à partir de tissus pulmonaires réséqués préalablement obtenue CD31highv3high et CD31highv3low (Figure 5).

L'efficacité de formation de colonies des organoïdes sera comparée dans ces deux conditions.

Sélection des participants à l'étude
Des explants pulmonaires humains seront obtenus auprès de patients subissant une chirurgie thoracique. Les patients seront sélectionnés selon les critères d'inclusion et de non-inclusion suivants.
- Critères d'inclusion
- Âge 18 ans
- Patients subissant une chirurgie thoracique avec résection pulmonaire (lobectomie, pneumonectomie ou segmentectomie), sans tenir compte de la motivation chirurgicale
- Consentement à participer au protocole
- Affiliation à un régime de sécurité sociale

- Critères de non-inclusion
- Maladie auto-immune chronique connue
- Chimiothérapie néoadjuvante
- Radiothérapie thoracique
- Patients sous tutelle ou curatelle

Les patients seront considérés comme fumeurs s'ils ont fumé plus de 10 paquets-années et comme emphysémateux si le pourcentage d'emphysème dans le poumon est supérieur à 10% (pourcentage de zone pulmonaire avec une densité HU inférieure à -910). Le pourcentage d'emphysème sera évalué via le logiciel StratX (PulmonX).
En se basant sur le recrutement du service de pneumologie, le pourcentage de fumeurs actifs et d'anciens fumeurs (depuis plus d'un an) devrait être respectivement de 60 % et 40 % parmi les fumeurs.

Justification de la taille de l'échantillon et faisabilité
Pour la réalisation des cultures endothéliales monocouche, chaque prélèvement permettra d'obtenir une population v3high et v3low. Un minimum de 3 patients par groupe est nécessaire avec de plus la nécessité de répéter les prélèvements pour les études pharmacologiques. Un nombre de sujet de 9 patients est attendu pour les cultures en monocouche. Pour la réalisation des sphéroïdes (nombre de sphéroïdes en fonction de l'v3), le nombre de sujets nécessaires a été estimé en supposant que la formation d'organoïdes serait de 50 et 30 pour les groupes avec des cellules endothéliales v3 élevées et v3 faibles, respectivement, avec un écart-type de 20. Avec un risque de type 1 de 5 % et un risque de type 2 de 10,0 %, nous estimons qu'il faudrait 20 patients par groupe.
Sachant que plus de 100 patients sont pris en charge chaque année par le service de pneumologie pour une chirurgie thoracique au Centre Hospitalier Universitaire de Nancy, nous estimons qu'un recrutement de 50 sujets serait largement possible en deux ans.

Méthodes d'analyse des résultats
Les variables quantitatives seront présentées sous forme de moyenne (± écart-type) ou de médiane (25-75e percentiles) selon la normalité de leur distribution, les variables qualitatives seront présentées sous forme de nombres (%). Les comparaisons intergroupes seront réalisées à l'aide du test du Chi2 ou du test exact de Fisher pour les variables binaires/catégoriques, en fonction des effectifs attendus, et pour les variables quantitatives à l'aide de tests t de Student ou de tests non paramétriques de Mann-Whitney (2 groupes), ou d'ANOVA et de Kruskall-Wallis (>2 groupes), selon le cas. La correction pour les tests multiples sera prise en compte avec la correction de Bonferroni.