Thèse Caractérisation des Facteurs Cellulaires Impliqués dans la Modulation des Activités de Réplication et Transcription du Virus Respiratoire Syncytial H/F

Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : VIM - Virologie et Immunologie Moléculaires
Direction de la thèse : Monika BAJOREK ORCID 0000000201604709
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est une cause majeure d'infections respiratoires sévères chez les nourrissons, les personnes âgées, les individus immunodéprimés et les animaux d'élevage (bovins). Il représente l'une des principales causes d'hospitalisation pédiatrique dans le monde. En médecine préventive humaine, on retrouve des vaccins ciblant la protéine F et des anticorps monoclonaux (Nirsevimab, Palivizumab) mais aucun traitement curatif n'existe. Identifier de nouvelles cibles antivirales reste donc nécessaire.
Le VRS est un virus enveloppé dont le génome est un brin d'ARN négatif qui code pour 11 protéines, dont les protéines qui assurent la transcription et réplication virale : N, P, L, M2-1. La nucléoprotéine N encapside les génomes viraux tandis que la protéine L est une enzyme qui catalyse la synthèse d'ARNs génomiques et messagers (1). La phosphoprotéine P possède plusieurs fonctions : elle stabilise la protéine L (complexe L-P), stabilise la protéine N en absence d'ARN (N°-P), et recrute le cofacteur de transcription M2-1 ainsi que d'autres protéines cellulaires (2).
Les activités de réplication et de transcription du VRS peuvent être modulées par des facteurs cellulaires : Des modifications post-traductionnelles (MPTs), en particulier des phosphorylations, ont été décrites comme pouvant moduler l'activité des protéines N, P et M2-1, toutefois leurs impacts sur les activités de la protéine L n'ont pas encore été étudiés (3). De plus, l'assemblage correct de L-P et la fonction de L sont étroitement régulés par le réseau de chaperons moléculaires de l'hôte, tels que Hsp70 et Hsp90 (4-6). Ce sont des machines de repliement essentielles et il a déjà été démontré qu'ils participent à la réplication du VRS. Cependant, les co-chaperons qui acheminent L vers HSP70 et HSP90 n'ont pas encore été identifiés (7).
Récemment, nous avons 1/ identifié des MPTs sur la protéine L par spectrométrie de masse. Parmi les phosphorylations, deux se situent près du site d'entrée de l'ARN viral, et un troisième se situe sur un domaine charnière. Leur localisation suggère qu'ils puissent réguler l'activité polymérase en modulant l'affinité de la polymérase pour son substrat ARN, et possiblement avoir un impact structural sur un état d'oligomérisation de L. 2/ D'autre part, bien que des kinases et phosphatases peuvent modifier l'état de phosphorylation de la protéine P, les enzymes permettant l'ajout ou le retrait de ces phosphorylations sur L ne sont pas connues. Récemment, une phosphatase cellulaire a été identifiée au laboratoire comme interagissant directement avec la protéine L, mais son implication dans les activités enzymatiques de L-P n'a pas encore été étudiée. 3/ Nous avons déjà réussi à sélectionner et à identifier des protéines chaperonnes à domaine J (JDP) interagissant spécifiquement avec les protéines N, P et M du VRS (non publié), à l'aide d'une bibliothèque de JDP cytoplasmiques, démontrant leur nécessité pour l'assemblage et le fonctionnement des protéines du VRS. Une approche similaire sera adaptée pour identifier les JDP interagissant avec la protéine L et analyser leur rôle dans le fonctionnement de cette dernière.
Le projet vise ainsi à (i) étudier l'impact fonctionnel de ces sites de phosphorylations potentiels sur les activités de réplication et de transcription de la protéine L, (ii) caractériser l'impact de l'interaction protéine L - phosphatase sur les activités de transcription/réplication (8, 9), et (iii) identifier les JDPs interagissant avec L. Des approches de biologie moléculaires (mutagénèse dirigée), de biologie cellulaires (transfections, immunofluorescence, test fonctionnel) et de biochimie (immunoprécipitation, western blot, biochimie) seront utilisées. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant l'activité de L et d'ouvrir la voie à de nouvelles approches antivirales ciblant la réplication du VRS.

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est une cause majeure d'infections respiratoires sévères chez les nourrissons, les personnes âgées, les individus immunodéprimés et les animaux d'élevage (bovins). En médecine préventive humaine, on retrouve des vaccins et des anticorps monoclonaux mais aucun traitement curatif n'existe. Identifier de nouvelles cibles antivirales reste donc nécessaire.
Le VRS est un virus enveloppé dont le génome est un brin d'ARN négatif qui code pour 11 protéines, dont les protéines qui assurent la transcription et réplication virale : N, P, L, M2-1. La protéine L est une enzyme qui catalyse la synthèse d'ARNs génomiques et messagers, et qui est stabilisée par la phosphoprotéine P (complexe L-P).
Ces activités sont dépendantes de protéines de l'hôte (Kinases, Phosphatases, Chaperones), mais leurs interactions ont encore été peu étudiées. D'une part, des modifications post-traductionnelles ont été décrites comme pouvant moduler l'activité des protéines N, P et M2-1. Nous avons récemment identifié la présence de sites de phosphorylations sur L et mis en évidence une interaction directe entre la protéine L et une phosphatase cellulaires (données non publiées), il est ainsi essentiel de comprendre la place de ces modifications post-traductionnelles dans les activités de réplication et transcription du VRS. D'autre part, l'assemblage même du complexe P-L est régulé par le réseau de protéines chaperones de l'hôte, en particulier HSP70 et HSP90. Ces chaperones nécessitent des co-facteurs spécifiques pour moduler leurs interactions et activités, en particulier de la famille des protéines à domaines J (JDPs, ~50 identifiées chez l'homme). Identifier les JDPs impliquées permettrait d'ouvrir la voie à de nouvelles stratégies antivirales ciblant spécifiquement la réplication et transcription du VRS.

Le projet proposé a pour but de mieux comprendre l'implication de facteurs cellulaires dans la modulation de l'activité de l'ARN polymérase du VRS. Les objectifs de ce projet seront
-Valider l'importance des résidus identifiés comme phosphorylés pour les activités de transcription et réplication, et la localisation cellulaire de la protéine L par le biais de tests fonctionnels et de marquages par immunofluorescence.
-Caractériser le rôle de l'interaction protéine L-phosphatases dans les activités de transcription/réplication du virus respiratoire syncytial.
-Identifier par une approche de criblage les co-chaperones (JDPs) cellulaires capable d'interagir avec la protéine L du VRS et valider leur impact fonctionnel sur la transcription/réplication du virus respiratoire syncytial.

Le projet implique des méthodes couramment utilisées au laboratoire : Construction de plasmides pour exprimer des variants de protéines étudiées par biologie moléculaire. Validation de l'expression des protéines et des interactions protéine-protéines par Western Blot (WB). Validation de la localisation des variants de L et ses cofacteurs dans les usines virales par microscopie à immunofluorescence. Mesure de l'impact des mutations sur l'activité de la protéine L par tests minigénome. Tests d'interaction in cellula par système split-luciférase. Purification de protéines pour étudier leur interaction in vitro en utilisant les systèmes de cellules d'insecte/Baculovirus, HEK293 Freestyle et E. coli.