Thèse Characterization Moléculaire des Facteurs Bactériens et Abiotiques Régulant l'Entrée et la Réversion dans l'État Vbnc chez Listeria Monocytogenes H/F

Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine
Direction de la thèse : Alessandro PAGLIUSO ORCID 0000000204215442
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

Les bactéries ont développé diérentes stratégies pour s'adapter aux stress environnementaux. Certaines espèces peuvent produire des structures hautement résistantes, appelées endospores, qui leur permettent de survivre dans un état de dormance profonde jusqu'à ce que des conditions favorables permettent la reprise de leur croissance végétative. Alternativement, les bactéries non sporulées peuvent passer dans un état dit « viable mais non cultivable » (VBNC), dont le statut métabolique se situe entre celui des cellules en croissance active et celui des endospores. En perdant leur capacité à se développer sur des milieux de culture classiques, les bactéries VBNC peuvent représenter un risque significatif pour la santé publique, comme c'est le cas pour les pathogènes d'origine alimentaire. En eet, la plupart des méthodes de détection microbiologique utilisées en milieu clinique et dans l'industrie alimentaire reposent sur la croissance microbienne, ce qui fait que les organismes VBNC potentiellement dangereux échappent à la détection. De plus, comme les cellules VBNC ne se divisent pas, elles sont tolérantes aux agents antimicrobiens ciblant les formes végétatives. Ce risque pour la santé publique est aggravé par la possibilité de réversion des pathogènes dormants VBNC à un état pleinement actif et virulent. Au cours des dernières années, notre équipe a étudié l'état VBNC chez le pathogène alimentaire ubiquitaire et opportuniste Listeria monocytogenes. Nous avons récemment démontré que dans l'eau, Listeria entre progressivement dans un état VBNC. Fait remarquable, cette adaptation est caractérisée par la disparition de la paroi bactérienne et une transition d'une forme de cellule en bâtonnet à celle d'une cellule sphérique. Ce phénotype est réversible, puisque Listeria peut revenir à un état replicatif pleinement virulent lorsqu'elle est inoculée dans des oeufs de poule embryonnés. L'objectif de cette thèse est d'identifier et de caractériser les acteurs moléculaires régulant la transition et le maintien dans l'état VBNC. De plus, notre modèle in vivo d'embryons de poulet pour la réactivation des cellules VBNC, nous permettra de comprendre les mécanismes de la sortie de l'état VBNC. Enfin, en utilisant des modèles murins appropriés, nous évaluerons à la fois la réactivation in vivo et le potentiel de virulence des Listeria à l'état VBNC. Ce travail permettra non seulement d'améliorer notre compréhension de la dormance bactérienne, mais pourrait également fournir des outils pour mieux détecter ce pathogène bactérien en état VBNC. Enfin, nos travaux pourraient également révéler de nouvelles cibles bactériennes prometteuses pour le développement de molécules antimicrobiennes.

Living organisms are constantly challenged with stressful stimuli in their environment and, as a result, have evolved adaptation strategies to ensure their survival. Bacteria employ a few mechanisms to endure under harsh and/or prolonged environmental stress, each leading
to dierent levels of dormancy. The most known is sporulation, whereby a cell generates a specialized daughter' cell (endospore) that is metabolically inactive and extremely resistant against various abiotic stresses and insults. Bacteria unable to perform sporulation can engage an alternative process that drives them into a shallower dormant state called viable but non-culturable (VBNC) state. As indicated in the name, VBNC cells are alive but have a slowed metabolic activity that translates into loss of the ability to grow on routine culture media. When favorable conditions return, VBNC cells can exit their dormant states and resume vegetative growth through a process called resuscitation. Most, if not all, of the bacterial species capable of entering a VBNC state are associated with food (products and spoilage) and agricultural systems. Importantly, over half of these species are known to cause disease in humans and animals. In this context, VBNC pathogens constitute a major public health and food safety hazard because, (i) due to their non-culturability, they are undetectable by standard surveillance methods based on microbial growth in rich culture media, and (ii) due to their resuscitating capacity, they can reactivate their virulence at any point along the food system chain, with particular danger to intermediary and end consumers. It is therefore of critical importance to identify the molecular mechanisms leading to VBNC transition and resurrection to improve public health, food safety and prevention of infection disease. Due to its ubiquitous presence in the environment, animals, and humans as well as in the food industry, Listeria represents an exceptional bacterial model to address this issues.

The project herein proposed aims to achieve a comprehensive understanding of the VBNC state via a thorough characterization of the bacterial mechanisms and factors regulating the formation, maintenance and reversion of the VBNC state.
i) Genetic traits modulating VBNC entry and maintenance will be identified by employing a high-throughput strategy based on the use of a library of Listeria transposon mutants (available in our lab). The role of candidate genes will be then elucidated by generating clean mutants and characterizing their phenotype. We plan to focus our attention on genes involved in stress response or cell wall metabolism.

ii) To identify bacterial factors involved in VBNC reactivation, we will use two complementary approaches. First, pure VBNC populations of the Listeria transposon mutant library will be inoculated into chicken embryos - our established in vivo model for VBNC state reversal - and the recovered vegetative populations will be compared to the initial VBNC mutant library pool by Tn-seq analysis. As a second
approach, we will test various physical conditions (e.g. temperature, pH, oxygen, osmotic pressure, redox balance), nutrients, metabolites, metals, etc. in a high-throughput in vitro screening to assess which factors can trigger the revival of VBNC cells. VBNC populations of the Listeria transposon mutant library will be then exposed to these conditions to find genes needed for reactivation.

iii) To assess the in vivo reactivation and virulence potential of VBNC Listeria, murine models will be challenged with pure VBNC samples (at different time of dormancy transition), in collaboration with Marc Lecuit (Pasteur Institute, Paris). A knock-in humanized KIE6P mouse model, highly permissive to Listeria infection will be used for this purpose. We will investigate the role of the infection route (intravenous vs oral) on in vivo VBNC reactivation, tissue colonization (intestine, colon, liver, spleen, brain, lymph nodes), fecal shedding, and potential silent carriage. To evaluate the role of the microbiota in VBNC revival, we will perform infections in germ-free mice. Moreover, since Listeria mostly targets immunocompromised people, we will recapitulate this scenario by performing VBNC administration in immunocompromised mice (Rag1 KO) or KIE16P mice treated with a blocking T cell antibody. We will study infection both quantitatively (CFU counts and bacterial DNA detection) and qualitatively (histopathology, cytometry including sorting of infected cells). This comprehensive in vivo approach, will ultimately clarify whether VBNC Listeria can silently persist and regain virulence inside a living host, with significant implications for public health

The project will involve methods in classical microbiology, microbial genetics, molecular biology, microscopy, as well as genomic and transcriptomic analysis and cell wall profiling.