Thèse Contrôles Moléculaires du Statut Cellule Souche' dans le Lignage des Kératinocytes de l'Épiderme Humain Réseaux de Régulation des Facteurs de Transcription Klf4 et Mxd4 - Mad4 H/F

Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : Stabilité génétique, Cellules Souches et Radiations
Direction de la thèse : Gilles LEMAITRE ORCID 0000000208981582
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

Les cellules souches résidentes de l'épiderme adulte sont dotées de remarquables capacités d'autorenouvellement et d'organogenèse, sur lesquelles reposent le maintien à long terme de l'homéostasie de ce tissu, ainsi que son potentiel de régénération. Ces cellules constituent un modèle d'étude pour aborder le concept de réseau moléculaire déterminant le statut cellule souche' ou stemness' (Fortunel et al. Science 2003) dans un tissu humain. Approfondir la connaissance de leurs déterminants moléculaires est nécessaire pour faire progresser la bio-ingénierie des substituts cutanés, historiquement utilisés pour la greffe chez les grands brûlés (Ronfard et al. Transplantation 2000) et plus récemment pour des approches de thérapie génique (Hirsch et al. Nature 2017).
Le Laboratoire de Régénération et Radiopathologies Cutanées (LR2C) a décrit l'importance de deux facteurs de transcription, KLF4 et MXD4/MAD4, dans la régulation de la balance « immaturité versus différenciation » de ces cellules souches, en relation avec la voie de signalisation du TGFB1. Abaisser le niveau d'expression de l'un ou l'autre de ces facteurs par interférence ARN permet de mieux maintenir le caractère cellule souche' en contexte d'expansion ex vivo, avec pour effet une préservation plus efficace de leur capacité à reconstruire un épiderme tridimensionnel (Fortunel et al. Nat Biomed Eng 2019 et Coutier et al. J Invest Dermatol 2023).
Une analyse in silico des signatures transcriptionnelles modulées en réponse à un ciblage anti-KLF4 ou anti-MXD4/MAD4 a été réalisée, pointant de manière prospective un réseau de régulation comprenant des transcrits codants et des ARNs non codants (Vinasco-Sandoval et al. Int J Mol Sci 2024). La réalité des mécanismes ainsi proposés doit à présent être documentés expérimentalement. Le projet de thèse s'appuiera sur ces socles de résultats pour acquérir de nouvelles connaissances sur la mécanistique des contrôles du statut stemness' dans les cellules souches kératinocytaires de l'épiderme humain.
Un premier aspect abordé portera sur la convergence des réponses cellulaires contrôlées par KLF4 et MXD4/MAD4. Ce phénomène de reprogrammation cellulaire induit indépendamment par les deux facteurs sera étudié par une approche multi-OMICs visant à intégrer différents niveaux d'analyse du génome et de l'expression génique. L'analyse comprendra une cartographie des séquences cibles des facteurs de transcription KLF4 et MXD4/MAD4 à l'échelle du génome complet (ChIP-Seq), une cartographie des zones ouvertes-actives' et fermées-inactives' du génome en contextes cellulaires représentatifs de degrés d'immaturité distincts (ATAC-Seq), et des analyses du transcriptome sur populations et à l'échelle de la cellule unique (bulk- et single-cell-RNA-seq). Cette analyse intégrée apportera un éclairage sur l'interdépendances des mécanismes d'action de KLF4 et MXD4/MAD4.
Un second aspect abordé aura pour objet la recherche d'effets coopératifs de KLF4 et MXD4/MAD4 sur le maintien du statut stemness' et la capacité régénératrice des cellules souches kératinocytaires. Considérant des mécanismes d'action au moins partiellement distincts, l'hypothèse explorée envisage la possibilité d'obtenir une réponse plus efficace en ciblant les deux facteurs, par rapport à un ciblage individuel de l'un ou l'autre. L'approche fonctionnelle reposera sur l'utilisation de modèles organoïdes épidermiques, qui seront mis à profit pour réaliser des expériences de traçage cellulaire et de régénération compétitive, à partir de cellules présentant une expression diminuée de KLF4 ou de MXD4/MAD4.
Le projet revêt ainsi une double portée : 1) au niveau recherche amont, acquisition de connaissances originales sur les mécanismes moléculaires régissant le maintien des cellules souches kératinocytaires ; 2) sur un plan translationnel, approfondissement de pistes de travail pour augmenter la capacité régénératrice de substituts de peau issus de bio-ingénierie en culture.

La peau constitue un modèle biologique particulièrement adapté pour étudier les cellules souches tissulaires chez l'humain, et explorer leur champ d'applications thérapeutiques. Plus généralement, l'accès à des échantillons de peau humaine adulte, et la possibilité qui en découle de développer des modèles cellulaires en 2D et des organoïdes en 3D, permettent la réalisation d'études de processus physiologiques et de dérégulations pathologiques affectant cet organe.

Dans ce cadre, les recherches menées par le LR2C se déclinent selon trois volets :

(1) - Déterminants moléculaires du caractère 'cellule souche' ou 'stemness'.
(2) - Substituts cutanés issus de culture.
(3) - Radio-pathologies cutanées.

Le projet, se positionne à un niveau amont de recherche, et s'inscrit dans le volet (1) des recherches du LR2C. Ce premier volet porte sur la connaissance des caractéristiques fondamentales des cellules souches et progéniteurs épithéliaux de l'épiderme interfolliculaire et du follicule pileux. Cet axe amont a en particulier pour objet la connaissance des déterminants moléculaires du caractère 'cellule souche' (ou 'stemness'), ainsi que le décryptage des réseaux de régulation de la balance immaturité versus différenciation', dans ces modèles de cellules souches tissulaires. La voie du TGFB1 et les facteurs de transcription associés sont notamment étudiés pour leur implication dans le contrôle du caractère 'stemness' et de la capacité d'autorenouvellement des cellules souches épithéliales cutanées (Fortunel et al. J Cell Sci 2003 ; Fortunel et al. Nat Biomed Eng 2019 ; Coutier et al. J Invest Dermatol 2023).

Plus globalement, ces recherches intègrent le génome codant conventionnel (gènes codant le protéome), et l'épigénome (gènes produisant des transcrits non codants), en particulier la classe des ARNs longs non codants (lncRNAs), dont les fonctions régulatrices suscitent un intérêt croissant pour la compréhension des réseaux de régulation de l'homéostasie de l'épiderme (Lopez-Pajares et al. Dev Cell 2015 ; Ziegler et al. EMBO Rep 2019).

Découlant de ces recherches amont, le volet (2), vise l'apport de concepts et d'innovations au bénéfice du domaine des thérapies cellulaires et tissulaires cutanées. Une piste de travail explorée porte sur le développement de compositions moléculaires et d'effecteurs promoteurs d'une action pro-'stemness', permettant une préservation plus efficace des cellules souches épidermiques dans le contexte d'architectures de bio-ingénierie de substituts cutanés. Leur maintien durant le processus de culture conditionne en effet le potentiel régénératif des greffons obtenus (Enzo et al. Methods Cell Biol 2022).

Ces recherches de construction amont-aval sont soutenues dans le cadre du plan d'investissement France 2030. Elles s'inscrivent dans le programme PEPR ciblé « Bioengineered Skin-France », qui est coordonné par le LR2C (https://pepr-biotherapies.fr/2023/12/08/bioengineered-skin-france/).

Ce contexte de recherche fournira un environnement particulièrement apprenant pour le ou la doctorant(e), sur les enjeux et connexions liant recherche amont, bio-ingénierie, et attentes cliniques.

- Les investigations menées au niveau de strates moléculaires ont pour objectifs :

- L'obtention d'une cartographie des cibles des facteurs de transcription KLF4 et MXD4/MAD4 à l'échelle du génome global.
- L'obtention d'une cartographie des régions ouvertes-actives' et inactives-fermées' du génome, dans des cellules représentatives de degrés d'immaturité / maturité distincts.
- La définition de profils transcriptomiques de populations et sous-populations de cellules représentatives de degrés d'immaturité / maturité distincts.

- Les investigations menées sur un plan fonctionnel ont pour objectifs :

- Obtention de données issues d'expériences de traçage cellulaire à partir de cellules présentant une expression diminuée de KLF4 ou de MXD4/MAD4.
- Obtention de données issues d'expériences de régénération compétitive à partir de cellules présentant une expression diminuée de KLF4 ou de MXD4/MAD4.

Le projet s'appuiera sur les modèles cellulaires en place au LR2C : cellules primaires extraites d'échantillons de peau humaine ; sous-populations de cellules de peau enrichies en cellules souches et/ou en progéniteurs ; cultures de masse et clonales, en conditions favorisant l'autorenouvellement des cellules souches et le maintien de leur caractère indifférencié ; organoïdes cutanés tridimensionnels.

Les moyens technologiques et équipements mis à profit du projet comprennent notamment : la plate-forme de cytométrie en flux CEA-Genopole (réseau OCCIGEN) hébergée au laboratoire (tri cellulaire et analyses multiparamétriques) ; la PCR digitale en gouttelette (ddPCR), qui permet de réaliser des quantifications de transcrits faiblement représentés.

Il s'appuiera également de manière majeure sur les compétences en génomique fonctionnelle maitrisées au sein de l'équipe et/ou dans son réseau, notamment : profilage transcriptionnel par séquençage (bulk et single-cell RNA-seq) ; cartographie des zones ouvertes-actives et fermées-inactives du génome (ATAC-Seq) ; vecteurs viraux (expressions inductibles, knock-down) ; bio-analyse in silico, bio-statistique.