Thèse de l'Hématopoïèse Clonale Mutée Tp53 aux Hémopathies Myéloïdes Induites Caractérisation Multi-Dimensionnelle et Longitudinale H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health École doctorale : Cancérologie : Biologie - Médecine - Santé Laboratoire de recherche : Cellules souches hématopoïétiques et développement des hémopathies myéloïdes Direction de la thèse : Aline RENNEVILLE ORCID 0000000308059640 Début de la thèse : 2026-11-02 Date limite de candidature : 2026-06-30T23:59:59 Contexte scientifique
L'hématopoïèse clonale de signification indéterminée (CHIP) définit l'expansion de clones hématopoïétiques mutés chez des individus sans maladie hématologique et constitue un état pré-leucémique. L'exposition aux traitements cytotoxiques augmente l'incidence des CHIP (25% des patients traités pour cancer), avec sélection de mutations, notamment de TP53, et un risque accru de néoplasies myéloïdes induites (t-MN) de mauvais pronostic.

Questions posées
Si des altérations pro-inflammatoires TP53-dépendantes sont décrites au stade de CHIP, et que les t-MN mutés TP53 présentent majoritairement une inactivation bi-allélique de TP53 associée à une instabilité génomique, la dynamique reliant ces états biologiques et génétiques au cours de la progression clonale reste mal caractérisée. Ce projet vise ainsi à identifier les déterminants génétiques et non génétiques de la progression des CHIP mutées TP53. Il s'agit de déterminer si les mutations de TP53 induisent, dès le stade de CHIP, un remodelage transcriptionnel spécifique des cellules hématopoïétiques, d'identifier d'éventuelles signatures protéomiques plasmatiques associées à la présence du clone muté, et de comprendre comment ces altérations évoluent lors de l'expansion clonale et de l'acquisition d'une altération bi-allélique de TP53.

Méthodologie
Ce projet s'appuie sur un suivi longitudinal de survivants de cancer solide ou d'hémopathie lymphoïde porteurs de CHIP mutées TP53. Nous étudierons l'impact des mutations de TP53 sur le transcriptome des cellules hématopoïétiques à l'échelle unicellulaire grâce à l'utilisation de long-read single-cell RNA sequencing, permettant l'assignation conjointe du profil transcriptionnel et du statut mutationnel de TP53 dans chaque cellule, et la comparaison des cellules mutées et non mutées au sein d'un même patient. En parallèle, le protéome plasmatique sera analysé de manière longitudinale afin d'en étudier les associations avec la dynamique clonale. Chez les patients présentant une expansion du clone, l'évolution du statut allélique de TP53 et l'instabilité génomique seront étudiées par séquençage longitudinal, permettant une intégration multi-omique des données génétiques, transcriptionnelles, et protéomiques.

Résultats attendus
Ce projet vise à établir l'impact des CHIP mutées TP53 sur le programme transcriptionnel des cellules mutées versus non mutées au sein des différents sous-type cellulaires, ainsi que les interactions réciproques entre le clone muté TP53 et le protéome plasmatique, afin d'améliorer notre compréhension des phases précoces de la leucémogenèse. D'autre part, nous déterminerons si l'instabilité génomique des t-MN précède ou résulte de la perte biallélique de TP53. L'intégration des données génétiques avec la dynamique des signatures transcriptionnelles et plasmatiques permettra d'identifier les déterminants de la progression clonale, des biomarqueurs précoces de la transformation maligne et des voies actionnables sur le plan thérapeutique dans le but de limiter l'expansion du clone muté TP53, en agissant sur le clone lui-même ou sur les facteurs extrinsèques qui lui confèrent un avantage sélectif.
Contexte
L'hématopoïèse clonale de signification indéterminée (CHIP, Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential) désigne l'expansion de clones dérivés de cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) porteuses de mutations somatiques, à une fréquence allélique (VAF, variant allele frequency) 2%, chez des individus sans maladie hématologique [1]. Associée à une cytopénie inexpliquée, l'entité est définie comme une cytopénie clonale de signification indéterminée (CCUS, Clonal Cytopenia of Undetermined Significance). Les CHIP/CCUS sont des états pré-leucémiques, avec un risque annuel de transformation en hémopathie maligne de 1% [2].
La prévalence des CHIP augmente avec l'âge (10% après 70 ans) et est plus élevée chez les patients atteints de cancer exposés aux traitements anticancéreux (25%), avec un enrichissement en mutations des gènes de la réponse aux dommages de l'ADN (TP53, PPM1D, CHEK2) sélectionnées sous pression thérapeutique [3].
Les patients atteints de cancer porteurs de CHIP mutée TP53 ont un risque accru de transformation en hémopathies myéloïdes induites (t-MN, therapy-related Myeloid Neoplasm) [3], typiquement chimio-résistantes, et de pronostic très défavorable (survie à 5 ans <2%) [4] et dont les déterminants biologiques de l'évolution clonale sont encore peu caractérisés.
Le Clonal Hematopoiesis Risk Score est un outil stratifiant ce risque hématologique, mais peu adapté aux CHIP mutées TP53 notamment chez les patients exposés aux traitements cytotoxiques car il ne prend pas en compte, entre autres, la pression de sélection induite par les traitements [5-6]. En effet, des données récentes suggèrent une progression du clone muté TP53, sous pression génotoxique, d'un état monoallélique vers un état biallélique associé à une instabilité génomique [4,7,8]. De plus, les clones mutés TP53 se distinguent biologiquement avec, au stade pré-leucémique, une activation aberrante de voies inflammatoires dans les CSPH mutées TP53 (axe NLRP1-IL-1/IL-6) associée à un avantage compétitif [9] puis au stade leucémique, une surexpression d'un programme érythroïde aberrant [10]. Ceci souligne l'importance de comprendre les déterminants biologiques gouvernant l'évolution des CHIP mutées TP53 vers des t-MN afin d'intercepter précocement la transformation [4,5].

Hypothèses de travail
Hypothèse globale : Une étude longitudinale de patients porteurs d'une CHIP mutée TP53 pourrait permettre de définir des stratégies d'interception précoce du processus de transformation maligne.
Hypothèse 1 : Les CHIP mutées TP53 s'accompagnent d'un remodelage précoce du transcriptome des cellules hématopoïétiques mutées TP53 comparativement aux cellules non mutées du même sous-type chez un patient donné.
Hypothèse 2 : Les patients porteurs de CHIP mutées TP53 présentent un profil protéomique plasmatique distinct de ceux de sujets contrôles sans CHIP.
Hypothèse 3 : Une analyse longitudinale intégrée des signatures transcriptionnelles et protéomiques et des événements génétiques permettra l'identification de voies biologiques clés impliquées dans la transformation maligne des CHIP mutées TP53.
Hypothèse 4 : La mise en évidence de signatures transcriptionnelles et/ou de marqueurs plasmatiques associés à l'expansion du clone muté TP53 pourrait révéler des vulnérabilités thérapeutiques potentiellement actionnables.

Aspects originaux
L'originalité de ce projet de thèse repose sur une approche de suivi longitudinal, inédite à ce jour, visant à étudier, sur une durée réaliste et à l'aide de technologies innovantes, l'évolution des clones mutés TP53 depuis le stade de CHIP jusqu'à la transformation en t-MN avec le potentiel d'identifier des voies biologiques ciblables sur le plan thérapeutique.
Ce travail de thèse comprend deux objectifs complémentaires :

Objectif 1 : Etude de l'impact des mutations de TP53 sur le phénotype des cellules hématopoïétiques chez des individus porteurs de CHIP

Objectif 2 : Analyse des mécanismes génétiques et non génétiques associés à la progression des CHIP mutées TP53 Stratégie et Méthodes envisagées
Ce projet s'appuie sur le programme Clonal Interception de Gustave Roussy (GR), qui a permis la constitution d'une cohorte prospective de patients adultes porteurs de CHIP/CCUS après cancer solide ou hémopathie lymphoïde. Depuis 2022, 72 patients ont été inclus dont 4 ont évolué en t-MN, 25 patients sont porteurs d'une ou plusieurs mutations de TP53 de VAF moyenne de 9%), dont 1 a évolué en t-MN. Tous les 6 mois pendant 3 ans sont réalisés entre autres un recueil de données clinico-biologiques, un prélèvement sanguin pour numération formule sanguine, panel NGS de 174 gènes et conservation de cellules (PBMC, CD34+, CD3+).

Objectif 1 : Etude de l'impact des mutations TP53 sur le phénotype des cellules hématopoïétiques chez des individus porteurs de CHIP
1.1) Définir la signature transcriptomique des cellules hématopoïétiques mutées TP53 au stade de CHIP
Rationnel : L'impact des mutations de TP53 au stade de CHIP sur le profil d'expression génique au sein des sous-populations cellulaires sanguines (monocytes, lymphocytes B, T, NK) et CSPH CD34+ est inconnu.
Cohorte et Méthodologie : Une analyse transcriptomique à l'échelle unicellulaire couplée à un génotypage de chaque cellule, chez 5 patients porteurs de CHIP mutée TP53, permettra une comparaison du transcriptome des cellules mutées TP53 à celui des cellules non mutées, au sein des différents sous-types cellulaires.

1.1.1) Optimisation du protocole de long-read single-cell RNA sequencing
Les données de long-read single-cell RNA sequencing (PromethION, Oxford Nanopore, plateforme de génomique de GR dirigée par N.Droin) utilisant la chimie 3' GEMX (10x Genomics) seront analysées sur 5 cas de CHIP mutée TP53 de VAF >15% à partir de PBMC lympho-déplétées et enrichies en CD34+, permettant l'analyse conjointe du transcriptome des CSPH et des cellules sanguines matures.

Le séquençage 3'GEM-X génère des fragments de 1000 pb en médiane, plus courts que le 3'UTR de TP53 (~1200 pb) limitant la couverture des mutations hotspots sur ce gène. Afin d'optimiser le nombre de cellules génotypées, une stratégie d'enrichissement ciblé de la région de TP53 comportant les hotspots mutationnels par PCR nichée sera mise en oeuvre à partir de la librairie long-read, en adaptant des protocoles déjà publiés [11,12].

1.1.2) Analyse comparative du transcriptome des cellules mutées TP53 et non mutées au sein de chaque population cellulaire
Analyse bio-informatique en 3 étapes : (i) Identification des sous-types cellulaires par clustering non supervisé (méthode Leiden) et annotation par projection sur des atlas de référence (Seurat, Scanpy, Azimuth) [13,14,15]; (ii) Assignation du statut génotypique unicellulaire à partir de données long-read et d'enrichissement ciblé de TP53 (Pileup, CellSNP-lite) [16,17]; (iii) Comparaison de gènes différentiellement exprimés entre les cellules mutées TP53 et non mutées, par sous-type cellulaire, et identification de signatures spécifiques du clone muté TP53 (Seurat, DESeq2) [13, 18].

1.2) Recherche d'une signature protéomique plasmatique associée à la présence d'une CHIP mutée TP53
Rationnel : Les associations entre CHIP et signatures protéiques plasmatiques, décrites pour les mutations de DNMT3A et TET2, sont peu explorées pour les mutations TP53 qui sont rares dans la population générale [19].
Cohorte et Méthodologie : comparaison du protéome plasmatique de 30-35 patients mutés TP53 au stade de CHIP (25 cas disponibles et 5-10 attendus) par rapport à celui de patients contrôles (n=20) traités pour un cancer mais sans CHIP. Le dosage par la technologie Olink (panel Explore-HT, plateforme GenoBioMics, INSERM U955, CHU H. Mondor, Créteil) permettra l'évaluation de 5400 protéines plasmatiques, dont 590 considérées cibles actionnables. Les signatures transcriptionnelles et protéomiques seront comparées afin de déterminer leur relation réciproque. Les protéines les plus significativement dérégulées et biologiquement pertinentes seront quantifiées par une autre méthode (ex. ELISA ou Luminex) pour validation.

Objectif 2 : Analyse des mécanismes génétiques et non génétiques associés à la progression des CHIP mutées TP53
Rationnel : Si le statut monoallélique des mutations TP53 au stade de CHIP et l'association perte d'hétérozygotie-instabilité génomique au stade t-MN sont établis, la reconstruction des évènements génétiques et leur impact biologique au cours de l'évolution clonale restent mal définies.
Cohorte : 15 patients avec expansion du clone muté TP53 (augmentation relative de la VAF d'au moins 10% et/ou suspicion d'atteinte biallélique) seront sélectionnés grâce aux données séquentielles de NGS, en donnant la priorité au cas de t-MN (5 patients déjà disponibles dont 1 cas de t-MN ; 10 cas de progression attendus à mi-parcours de ma thèse).

2.1) Établissement de la séquence des évènements entre l'altération biallélique de TP53 et l'instabilité génomique
Le paysage génétique global (annotation de la charge mutationnelle, anomalies de nombre de copies focales et/ou chromosomiques et des variants structuraux) de 10 patients sera déterminé, dont le statut allélique de TP53 (perte d'hétérozygotie avec ou sans perte de matériel génétique) à l'aide de l'outil FACETS [20] et l'instabilité génomique à partir de données de séquençage de génome entier (WGS, Whole Genome Sequencing) à haute profondeur (100X) réalisé en bulk sur PBMC sur a minima 3 échantillons de suivi (initial, intermédiaire, et évolution ou t-MN).

2.2) Détermination des voies biologiques associées à la progression de l'hématopoïèse clonale mutée TP53
2.2.1) Etude du remodelage transcriptionnel au cours de la progression clonale
Une analyse bioinformatique des données de long-read single-cell RNA sequencing générées chez 5 patients au stade évolutif (VAF proche de 50% ou perte biallélique) ou t-MN si disponible sera réalisée selon le protocole de l'axe 1.1, en se focalisant sur la dynamique des programmes transcriptionnels lors de la progression clonale.

2.2.2) Identification des biomarqueurs plasmatiques associés à la progression de l'hématopoïèse clonale mutée TP53
Chez tous les patients avec une évolution du clone muté TP53, nous analyserons de façon séquentielle le protéome plasmatique (cf 1.2) afin d'établir la dynamique des signatures protéiques d'identifier des biomarqueurs circulants prédictifs de la transformation. Ces données seront intégrées à celles du transcriptome pour déterminer si les variations protéiques sont en rapport ou non avec le clone muté TP53.