Thèse Petites Colonies Grands Problèmes. Place de l'Hétérogénéité des Small Colony Variant dans les Infections Chroniques à Staphylococcus Aureus H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Claude Bernard Lyon 1 École doctorale : E2M2 - Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation Laboratoire de recherche : CIRI - CENTRE INTERNATIONAL DE RECHERCHE EN INFECTIOLOGIE Direction de la thèse : Anne DOLEANS-JORDHEIM ORCID 0000000349853955 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-09T23:59:59 Contexte : Staphylococcus aureus est un pathogène redouté en clinique, responsable d'infections variées, des lésions cutanées aux syndromes systémiques (pneumonies, bactériémies, endocardites, chocs toxiniques). Il persiste dans des contextes cliniques graves : grands brûlés, mucoviscidose (48,5 % des patients colonisés en 2023, dont 29,2 % de manière chronique), infections ostéo-articulaires (26 % des cas en France) ou pieds diabétiques. Ces infections chroniques entraînent une morbidité élevée, des hospitalisations prolongées, des échecs thérapeutiques (résistances aux antibiotiques) et des décès.
Parmi les mécanismes de persistance, les SCV (variants à petites colonies) se distinguent par une croissance lente, des colonies peu pigmentées et faiblement hémolytiques, une paroi épaisse et des profils biochimiques atypiques, rendant leur détection difficile. Leur émergence résulterait de stress sub-létaux prolongés (physico-chimiques, nutritionnels, antibiotiques, interactions bactériennes ou intracellulaires). Les SCV sont associés à la persistance intracellulaire, la formation de biofilms et la résistance aux antibiotiques, compliquant leur éradication. Leur hétérogénéité s'explique par des altérations métaboliques (déficits dans la chaîne de transport d'électrons, biosynthèse de thymidine, catabolisme de l'arginine) ou des mutations (opérons hem, men, gène thyA), mais aussi par des modifications épigénétiques ou des dysrégulations (facteurs MgrA, Agr, RsbU). Leur origine reste cependant mal élucidée.

Objectifs : ce projet propose une approche intégrée pour :
1/ Comprendre les mécanismes d'émergence des SCV sous différents stress, à partir de souches cliniques issues d'infections ostéo-articulaires (IOA), de pneumopathies chez les patients mucoviscidosiques, et d'infections cutanées.
2/ Caractériser leur hétérogénéité via des analyses omiques (génomique, transcriptomique, métabolomique, épigénétique) et phénotypiques.
3/ Analyser leur impact dans la persistance des infections (biofilms, résistance aux antibiotiques, survie intracellulaire).

Matériel et méthodes : les différentes étapes reposent sur :
* la sélection des souches : 50 isolats cliniques (16 IOA, 16 pneumopathies MV, 16 infections cutanées) + 2 souches de référence (S. aureus 6850 et 8325).
* l'induction des SCV : Exposition à 6 types de stress (physico-chimique, nutritif, oxydant, bactérien, antibiotique, intracellulaire) pendant 24h et 30 jours.
* la caractérisation des SCV :
- Fréquence et stabilité des SCV (dénombrement via ImageJ®, subcultures).
- Analyses omiques : Séquençage (NextSeq 550), transcriptomique (GeneWiz®), métabolomique (collaborations Grenoble/Nice), méthylation de l'ADN (SMRT-seq).
- Phénotypage : Auxotrophies (hémine, NAD, ménadione, thymidine), métabolisme (OmniLog®), potentiel électrique (DiOC(3) en FACS).
* l'étude de l'impact des SCV dans la chronicité : Étude de la formation de biofilms, de la sensibilité aux antibiotiques (CMI), et de l'interaction avec des cellules épithéliales (Calu3) ou ostéoblastes (MG63).

Perspectives : ce projet vise à :
1/ identifier les contextes cliniques et stress favorisant l'émergence des SCV.
2/ développer des marqueurs pour une prise en charge personnalisée (adaptation des antibiothérapies ou mesures hygiéno-diététiques).
3/ appliquer la méthodologie à d'autres bactéries ou situations cliniques.
À terme, ces résultats pourraient limiter la chronicité des infections à S. aureus et améliorer le pronostic des patients.
Staphylococcus aureus représente l'un des micro-organismes les plus redoutés en clinique, en raison de son aptitude exceptionnelle à provoquer une gamme étendue de pathologies, de l'infection cutanée localisée et superficielle aux syndromes systémiques graves tels que les pneumonies, les bactériémies, les endocardites ou encore les chocs toxiniques (Silva-Santana G, 2025). Cette bactérie se distingue aussi par ses capacités d'adaptation, à l'origine de colonisations persistantes et/ou d'infections chroniques. Ces situations cliniques, au profil souvent délétères, se retrouvent notamment au cours des atteintes cutanées décrites chez les grands brûlés, des pathologies pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose -patients MV- (en 2023, 48,5% des malades étaient colonisés par S. aureus dont 29,2% de façon chronique) ainsi que des infections ostéo-articulaires ou IOA (en France, environ 26% de ces IOA sont dues à S. aureus) et des délabrements en lien avec les « pieds diabétiques » (Registre français de la mucoviscidose - Bilan des données 2023 ; Lemaignen A, 2021 ; Plumet L, 2025). Ces infections chroniques sont redoutées en raison de leurs conséquences cliniques majeures en termes de morbidité et mortalité et de leurs impacts économiques. Elles sont ainsi responsables de douleurs prolongées, d'importantes dégradations fonctionnelles et d'amputations nécessitant des chirurgies répétées et des hospitalisations souvent longues. Ces pathologies sont également à l'origine de décès en raison des nombreuses difficultés de prise en charge et des échecs thérapeutiques (résistance accrue aux traitements) (DP Lew, 2004 ; Junge S, 2016 ; Masters EA, 2022).
Les stratégies permettant la persistance de S. aureus au cours des infections chroniques sont nombreuses. Elles résultent notamment de l'apparition de phénotypes adaptatifs spécifiques (Ogunware AE, 2025). Parmi ces derniers, les formes dites variants à petites colonies ou « Small Colony Variants » (SCV) se distinguent par leur croissance lente engendrant la formation sur gélose de colonies de petite taille, peu pigmentées et faiblement hémolytiques, par une paroi plus épaisse et des profils biochimiques atypiques rendant leur détection difficile (Mapar M, 2025).
La formation des SCV est décrite dans différents contextes cliniques (types d'infections et de prises en charge) et environnementaux (niches écologiques). Ces formes de survie de S. aureus (Kahl B, 2014) feraient suite à des pressions environnantes spécifiques sub-létales et prolongées telles que des modifications physico-chimiques, des stress nutritionnels ou provoqués par la présence d'autres bactéries ou d'antibiotiques (Islam S, 2022 ; Leimer N, 2016 ; Camus L 2021 ; Lin YT, 2016). Cependant, l'ensemble des phénomènes engendrant ces morphotypes demeure encore mal défini. Par ailleurs, ces SCV sont décrits dans les phénomènes de persistance intracellulaire bactérienne, d'adhésion à des surfaces (in)organiques sous formes de biofilms ou encore de résistance aux antibiotiques (Kahl BC, 2016), accentuant ainsi les difficultés d'éradication de la bactérie et donc les risques d'impasses thérapeutiques.
Compte tenu de la multiplicité des situations engendrant ces morphotypes, les SCV représentent un groupe hétérogène résultant de diverses modifications. Ces morphotypes qui sont soit stables soit réversibles après subculture sur milieux riches (Vulin C, 2018), peuvent être en lien avec des altérations métaboliques dont les plus décrits portent sur des déficits dans la chaîne de transport d'électrons et la production d'ATP à l'origine d'auxotrophies en ménadione ou hémine, sur la biosynthèse de thymidine ou encore sur le catabolisme de l'arginine (Mapar M, 2025). Des changements au niveau de certains facteurs de régulation (MgrA, Agr, RsbU) sont également observés (Lee J, 2020, Mapar M, 2025). Ces phénotypes peuvent être en partie expliqués par des mutations (dans les opérons hem et men ou dans le gène thyA induisant une résistance à l'antibiotique cotrimoxazole). Cependant, des cas sans mutations sont également décrits, montrant que l'origine du phénotype SCV reste mal définie (Lee J, 2020, Mapar M, 2025).
Ainsi, bien que souvent abordés dans la littérature, l'étude des SCV représente une problématique complexe en raison de leur diversité. Une meilleure compréhension de leur émergence et de leurs caractéristiques, ainsi que de leur implication dans les formes de persistance de S. aureus pourrait permettre de maitriser leur apparition ou de mieux les éradiquer. A terme, une meilleure prise en charge des patients présentant des infections chroniques à S. aureus pourraient être envisagée.
Dans ce projet, seront étudiés (i) les mécanismes d'émergence et le rôle de différents stress dans la production de SCV à partir de souches de S. aureus issues de situations cliniques distinctes, (ii) à caractériser l'hétérogénéité par différentes approches « omiques » et phénotypiques et (iii) à analyser l'impact des SCV dans la persistance des infections. Sélection et caractérisation des souches : un recueil de souches cliniques de S. aureus isolées respectivement d'IOA (n = 16) et de pneumopathies chez des patients MV (n = 16) sera effectué en collaboration avec l'Institut des Agents Infectieux des Hospices Civils de Lyon et le Centre National de Référence des Staphylocoques. Des souches isolées d'infections cutanées (n = 16) et 2 souches de références (S. aureus 6850 et S. aureus 8325) (Chuard C, 1997 ; Stoneham SM, 2020) complèteront cet échantillonnage (ntotal = 50). Les souches seront caractérisées au début de l'étude pour leur taille (culture sur gélose TSA et calcul des aires des colonies à partir d'analyses d'image sous imageJ®), leurs caractéristiques d'hémolyse et de pigmentation (géloses au sang/PVX) et leurs croissances en milieu TSA (courbes déterminées en multi-plaques (TECAN®)).

Induction du phénotype SCV : chaque isolat sera soumis à différents types de stress pendant 24h et 30 jours. Les pressions utilisées seront i) des stress physico-chimiques (exposition des souches à des osmolarités et des pH sub-létaux, culture en milieu hypersalé soit 8% de NaCl et culture en milieu acidifié pH=4,5 ou alcalinisé pH=9,5) ; ii) des stress nutritifs (exposition des souches au chélateur de fer 2,2-dipyridyl (Islam et al 2022)) ; iii) des stress oxydants (exposition des souches au méthyle viologène et au péroxyde d'hydrogène (Painter KL, 2015)) ; iv) des stress bactériens (co-culture des souches en présence de la bactérie P. aeruginosa, co-colonisant fréquent dans les infections pulmonaires des patients MV (Hoffman LR, 2006)) ; v) des stress en lien avec des antibiotiques (exposition des souches à des doses sub-léthales d'antibiotiques - gentamicine, vancomycine, daptomycine (Balwit 1994)) ; vi) des stress liés à un développement intracellulaire (culture sur des cellules de type macrophage (THP-1) ou épithéliale (Calu3)). Pour chaque expérience, des témoins (culture des souches sans stress) seront réalisées.

Fréquence d'apparition des SCV : à la suite d'une exposition à un stress (24h et 30 jours), la proportion de SCV produits par souche (identifiés en raison de leur taille réduite) sera déterminée par dénombrement à l'aide du logiciel imageJ®.

Stabilité des SCV : la stabilité du phénotype SCV sera évaluée par le calcul du taux de stabilité après 3 subcultures successives sans stress des SCV.

Caractérisation des SCV : A la suite de ces expériences et en fonction de la fréquence et de la pertinence du stress, une sélection de souches sera effectuée (3 par contexte clinique +/- les souches de référence), afin de construire des couples d'isolats (Souche initiale /SCV). En absence/présence de stress, chaque souche sera caractérisée et comparée par méthodes « omiques » : i) génomique (présence/absence d'ORF et de SNP après séquençage avec le système NextSeq 550 d'Illumina en technologie Paired-End 2 x 150 pb) ; ii) transcriptomique (via la société GeneWiz®, Azenta Life Sciences et analyse des données grâce à un « pipeline » développé par notre équipe StaPath du CIRI) ; iii) métabolomique grâce à une collaboration avec l'équipe grenobloise « Translational microbiology - Evolution - Engineering » (TrEE) (Dr A Le Gouellec) et l'équipe niçoise Holobiomics (Dr LF Nothias) ; iv)Une approche innovante est également proposée et repose sur la mise en évidence de formes épigénétiques adaptatives (profil de méthylation d'adénines et de cytosines par SMRT-seq, Plateforme Gentyane, INRAE, Clermont-Ferrand). Ces analyses omiques seront complétées par des analyses phénotypiques ciblant deux voies majoritairement altérées lors de la production de SCV, la chaine de transport d'électrons et la biosynthèse de la thymine. Des disques imprégnés d'hémine, de NAD (nicotinamide adénine dinucléotide), de ménadione (vitamine K3) et de thymidine recherchant l'auxotrophie des souches respectivement en hème, menaquinone et thymidine seront utilisés (Maduka-Ezeh A,2012). Le métabolisme bactérien sera de plus détaillé grâce à la technologie OmniLog ® (Von Eiff C, 2006). Enfin, la différence de potentiel électrique traduisant la force motrice protonique (PMF) générée par la chaine de transport des électrons sera évaluée par fluorescence par cytométrie en flux (FACS) après marquage DiOC(3) (Langlois JPl, 2020).
Impact des SCV dans la chronicité des infections : le comportement des isolats de chaque couple « souche initiale/SCV » sera évalué dans trois stratégies de survie et de persistance : i) la formation de biofilms (étude en microplaque suivie de coloration au cristal violet et culture) ; ii) la sensibilité aux antibiotiques (détermination de CMI en microplaque ou sur milieu gélosé pour la gentamicine, la vancomycine et la daptomycine) ; iii) l'adhésion et l'internalisation, la survie intracellulaire et la cytotoxicité lors de co-cultures avec des cellules épithéliales pulmonaires Calu3 et des ostéoblastes MG63 par dénombrement des bactéries et des cellules eucaryotes.