Thèse Caractérisation Structurale d'Une Protéine Muf de Bactériophage à Queue H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Environ un tiers des protéines MuF possèdent un domaine toxine C-terminal additionnel. C'est notamment le cas de la protéine F du phage tempéré Mu. Il est postulé que la toxine de F serait est transférée vers le cytoplasme bactérien au début de l'infection phagique avant que l'effet toxique soit inhibé dans un second temps, sans que l'on sache comment cette régulation s'opère.

Ce projet de thèse consistera à étudier par des approches structurales et fonctionnelles la protéine Mu F. Des essais de cristallisation de la protéine F recombinante, avec ou sans ADN seront entrepris. Par ailleurs, des reconstructions par cryo-microscopie électronique du complexe entre F et la protéine portale H seront entreprises, de même qu'une reconstruction de la procapside du phage Mu. Ces études à haute résolution seront complétées par une étude par spectrométrie de masse du devenir de la protéine F au cours de l'assemblage viral. Ce travail permettra de formuler des hypothèses sur le fonctionnement de F qui seront testées par phénotypage de mutants de la protéine.
L'équipe d'accueil étudie la biologie des bactériophages à queue par des approches multiples qui vont de la génétique à la biologie structurale en passant par l'imagerie cellulaire et la biochimie. Nos deux principaux objets d'étude sont les bactériophages modèles SPP1 qui infecte Bacillus subtilis et T5 qui infecte Escherichia coli. C'est sur SPP1 que nous avons entrepris la recherche sur les protéines MuF. Nous avons pu établir les principales caractéristiques fonctionnelles et structurales de la MuF de SPP1 , gp7. Nous avons également pu établir le devenir de cette protéine au cours de l'assemblage du bactériophage.
La présence d'un domaine toxine supplémentaire dans les MuF-Tox complexifie le système. Il pose également la question du rôle de ce domaine supplémentaire dans la biologie du phage. Cependant, ces Muf-Tox restent très peu comprises pour le moment. Afin de les étudier, nous avons mis en place des collaborations avec les équipes d'Anne Jamet à l'Hôpital Necker et d'Eric Cascales et Julie Viala du Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Macromoléculaires (LISM) à Marseille.
Nous avons choisi de focaliser nos efforts sur le bactériophage Mu, un phage tempéré infectant E. coli. Ce phage a été abondamment étudié et de nombreux outils sont disponibles pour le manipuler.
Le phage Mu possède une MuF, la protéine F qui a donné son nom à la famille MuF. Bien qu'il n'y ait plus d'identité de séquence détectable entre F et gp7 de SPP1, les prédictions de structure indiquent que ces deux protéines sont homologues et qu'elles ont les mêmes domaines N-terminaux. Cependant F possède en plus un domaine toxine qui pourrait être une tRNAse d'après des analyses de séquence (données non publiées). Des prédictions de structure suggèrent également une très forte interaction entre F et la protéine portale H de Mu.
A la différence de la plupart des phages possédant une MufTox, le phage Mu ne possède pas d'antitoxine. Cependant, on trouve dans la séquence complémentaire de Mu F une séquence correspondant à un ARN de transfert. Il est donc possible que le phage Mu utilise une stratégie différente pour inhiber l'effet toxique de Mu F, en produisant un ARNt de substitution.
Ce travail fait partie d'un projet plus large en collaboration avec l'équipe d'Eric Cascales et Julie Viala à Marseille, dont l'objectif est d'élucider le rôle, l'activité enzymatique, le mode de régulation et la structure des protéines MuF simples ou complexes de différents bactériophages.
1- Détermination de la structure cristallographique de la protéine F du phage Mu isolée ou en présence d'ADN
2- Reconstruction du complexe F-H de Mu par cryoME
3- Reconstruction de la procapside du phage Mu
4- Recherche d'un éventuel site de clivage de F dans la procapside de Mu
5- Construction et phénotypage de mutants de la protéine F de Mu
Aucune structure expérimentale d'une MuF à toxine n'est actuellement disponible. La protéine F du phage Mu est une protéine de 49 kDa. Les résultats sur SPP1 gp7 suggèrent que F sera probablement monomérique en solution. Des objets de cette taille sont particulièrement adaptés pour une étude structurale par cristallographie. Cependant comme cela a été observé pour gp7, il est possible qu'en l'absence de ses cofacteurs (complexe portal ou ADN double brin) aucun cristal de F ne puisse être obtenu. Nous utiliserons donc trois stratégies pour déterminer la structure de cette protéine. Ces stratégies feront appel à des méthodes différentes et dans le cas où plusieurs de ces stratégies fonctionneraient, elles apporteraient par ailleurs des informations complémentaires. Il s'agira de déterminer :
1- La structure de F par cristallographie de rayons X
2- La structure du complexe de F avec la protéine portale H de Mu par cryoME
3- La structure de la procapside du phage Mu par cryoME

1- La protéine F seule avec une étiquette hexahistidine sera surproduite en E. coli à l'aide d'un plasmide d'expression suivie par purification sur colonne d'affinité et exclusion de taille. A noter que nos collaborateurs du LISM à Marseille ont déjà montré la faisabilité de surproduire F pour des études fonctionnelles (résultats non-publiés). Des essais de cristallisation seront entrepris avant de conduire à une résolution par diffraction des rayons X. Des essais seront entrepris également en présence d'un ADN double brin court.
Dans le cas où nos collaborateurs du LISM parviendraient à identifier précisément le substrat du domaine toxine, la détermination de la structure du complexe entre F et son substrat deviendrait un objectif majeur. Il s'agirait de la première structure d'une protéine MuF avec son substrat. Dans ce cas le travail serait effectué également par cristallographie de rayons X.

2- Le complexe F-H sera surproduit en E. coli. Malgré la présence du domaine toxine, il est possible de produire cette protéine en E. coli. Le complexe sera purifié par colonne d'affinité et par exclusion de taille. Après contrôle de la qualité des échantillons par coloration négative, il sera observé par cryo-ME puis les images obtenues seront traitées afin d'obtenir une structure à haute résolution du complexe.

3- Une dernière approche consiste à produire la procapside du bactériophage Mu, le premier intermédiaire d'assemblage de la capside virale (Fig. 1). Quatre protéines sont attendues dans cet intermédiaire : la protéine d'échafaudage, la protéine majeure de capside, la protéine portale H et F. Dans cet intermédiaire, par analogie à nos résultats avec SPP1, on attend que F sera liée à la protéine portale, elle-même ancrée dans la procapside. Dans des particules virales infectieuses notre hypothèse est que F sera dissociée de la protéine portale et déplacée vers l'intérieur de la capside. En première intention, le phage Mu sera induit, les bactéries seront lysées et les particules virales en cours d'assemblage seront isolées par gradient de glycérol. Si la quantité de procapsides ainsi obtenue est insuffisante, il sera nécessaire de muter le prophage par CRISPR/Cas pour déléter le gène codant pour la grande sous-unité de la terminase, empêchant ainsi l'encapsidation du génome viral et conduisant ainsi à l'accumulation de procapsides dans la bactérie induite. Une stratégie similaire a été utilisée pour le phage SPP1.
Quelle que soit la méthode retenue pour produire les procapsides du phage Mu, celles-ci seront ensuite purifiées par ultracentrifugation sur gradient de glycérol. Si nécessaire, une étape supplémentaire de purification par échangeuse d'ions sera effectuée. Après contrôle de leur qualité, les procapsides seront alors observées par cryomicroscopie électronique. La reconstruction fera appel à des techniques complexes de reconstruction asymétrique. Ces techniques sont maitrisées dans le laboratoire et ont permis de déterminer la détermination de plusieurs structures asymétrique à haute résolution de particules virales.

Ce travail permettra la première étude structurale d'une MufTox, seule ou en présence de ses cofacteurs. Il permettra de comprendre le fonctionnement de la protéine, de préciser comment elle est recrutée, comment elle est positionnée dans la capside et en particulier où est localisé son domaine toxine. Dans le cas où le substrat de Mu F est déterminé, il apportera également des réponses sur son activité enzymatique. Cependant certaines questions essentielles nécessiteront d'autres méthodes.

Il est postulé que le domaine toxine des protéines MuF est transféré vers le cytoplasme de la bactérie hôte via la queue du phage au début de l'infection. Une première possibilité serait que la protéine MuF entière soit transférée. Une seconde possibilité serait que le domaine toxine serait clivé par protéolyse et livré seul dans la bactérie. En effet, comme beaucoup d'autres bactériophages à queue, Mu possède une protéase de maturation dont le rôle est de cliver la protéine d'échafaudage une fois la procapside formée. Cette protéase pourrait également cliver MuF. Afin de tester cette hypothèse, des particules virales du phage Mu seront analysées par spectrométrie de masse. Bien que les protéines MuF ne soient présentes que dans un faible nombre par capside, elles sont fortement chargées positivement et on observe donc une représentation élevée de peptides par spectrométrie de masse après digestion tryptique. Le spectre de F recombinante sera analysé puis comparé à son spectre dans les procapsides et dans les particules matures afin d'identifier un éventuel site de clivage.

Pour finir, les résultats précédents permettront de déterminer des acides aminés critiques pour la fonction de F, qu'il s'agisse de l'interaction avec Mu H ou avec son substrat. Ces acides aminés seront mutés dans le prophage Mu. Le phage sera alors induit et le phénotype des particules produites sera étudié. Des expériences de titration seront effectuées afin de déterminer le pourcentage de particules défectives. La capacité de ces protéines F mutantes à se lier à H sera testée par co-purification. Enfin, en fonction des informations disponibles sur l'activité enzymatique du domaine toxine, des essais d'activité de ces mutants sera entreprise.

Le(la) candidat(e) feront appel aux méthodologies suivantes pour mener le projet:
- Biologie moléculaire : clonage de gènes, mutagenèse dirigée
- Mutation et induction de prophages
- Production et purification de protéines
- Production de particules virales matures et d'intermédiaires d'assemblage
- Microscopie électronique : coloration négative et cryomicroscopie de particules uniques, reconstruction icosaédrique et asymétrique de particules virales
- Résolution de structure de protéine par cristallographie aux rayons X