Thèse Caractérisation de l'Ubiquitine Ligase Cereblon Crbn d'Arabidopsis et Utilisation pour la Dégradation Ciblée des Protéines H/F

Doctorat.Gouv.Fr

La dégradation ciblée des protéines chez les modèles animaux n'exploitent qu'un nombre très limité de ligases E3 de l'ubiquitine. La protéine humaine Cereblon (hsCRBN), récepteur de substrat du complexe de ligase E3 de type Cullin4-RING, est au premier plan de la dégradation ciblée grâce à de nombreux ligands dérivés du thalidomide appelés IMiDs (e.g. pomalidomide) qui fixent hsCRBN et servent de base au développement de PROTACs.

Nous avons identifié grâce à des analyses bioinformatiques une ligase E3 chez Arabidopsis qui possède une structure tridimensionnelle apparentée à hsCRBN, particulièrement au niveau du domaine de fixation du thalidomide. Des analyses de docking montrent notamment que cette protéine, maintenant appelée AtCRBN, peut accommoder des IMiDs. Le but de la Thèse sera donc d'étudier le concept de dégradation ciblée chez la plante modèle Arabidopsis thaliana en caractérisant AtCRBN.

Le premier objectif sera d'étudier en détail la protéine AtCRBN, apparentée à hsCRBN, afin de déterminer si ces deux protéines possèdent des propriétés interchangeables. En particulier, nous purifierons la protéine AtCRBN produite chez E. coli et caractériserons au niveau biochimique son activité de ligase E3 de l'ubiquitine in vitro, et son incorporation au niveau de complexe CRL4 par des approches de coimmunoprécipitation. La protéine AtCRBN sera également utilisée lors d'approches biochimiques et biophysiques (TSA, SPR, ITC ou MST) afin d'évaluer la capacité d'AtCRBN à fixer les IMiDs. Enfin, des cellules humaines knock-out pour hsCRBN seront transfectées avec AtCRBN et la complémentation fonctionnelle évaluée par la dégradation des cibles d'hsCRBN.

Le second objectif sera d'étudier la fonction d'AtCRBN chez Arabidopsis. Pour cela, nous disposons d'un mutant knock-out pour le gène AtCRBN, et sommes en train de générer un mutant CRISPR. La caractérisation phénotypique de ces mutants et l'étude des territoires d'expression et de régulation d'AtCRBN en réponses à de nombreuses conditions de croissance sera entreprise afin de mieux comprendre sa fonction biologique. En parallèle, une approche de TurboID que nous maitrisions dans l'équipe (Pellegrin et al., 2026), sera mise en place pour identifier les cibles endogènes d'AtCRBN. La validation des candidats issus du TurboID comprendra des approches de BiFC, coimmunoprécipitation, ubiquitination in vitro, et ubiquitination in vivo.

Le dernier objectif sera d'évaluer la possibilité d'utiliser AtCRBN pour mettre en place une stratégie de dégradation ciblée chez les plantes. Pour cela, la complémentation fonctionnelle du mutant Atcrbn, par hsCRBN- et AtCRBN-FKBP12, où FKBP12 est une étiquette pour laquelle existe un ligand, sera réalisée. Ces plantes seront transformées avec une série de fusions d'intérêts entre des protéines cytosoliques, nucléaires, membranaires, mitochondriales ou plastidiales, étiquetées avec Halo, sachant qu'Halo dispose également d'un ligand connu. La dégradation des fusions d'intérêt en réponse à un traitement PROTAC induisant la proximité entre FKBP12 et Halo, ou HsCRBN/AtCRBN et Halo grâce à des PROTAC basés sur le pomalidomide, sera étudiée par western blot et microscopie confocale. La dépendance pour le protéasome et AtCRBN sera testée par des approches pharmacologiques et génétiques. L'impact de la dégradation ciblée des fusions d'intérêt sur les cibles endogènes d'AtCRBN sera évalué par des approches de western blot, et de protéomique quantitative globale. L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle cruciale pour la dégradation des protéines. Bien que beaucoup de connaissances soient actuellement disponibles sur la machinerie d'ubiquitination chez les plantes et les fonctions biologiques associées, aucune information n'est actuellement disponible concernant la dégradation ciblée des protéines. Cette dernière est devenue un centre d'intérêt majeur dans le monde animal et médical de par i) sa capacité à renseigner sur les mécanismes fins de dégradation des protéines, ii) sa capacité à induire la dégradation d'une protéine d'intérêt de façon rapide, réversible et contrôlée, et surtout par la possibilité de devenir une modalité thérapeutique majeure permettant la dégradation de cibles thérapeutiques et donc de nombreux avantages comparé aux médicaments classiques qui fonctionnement comme des inhibiteurs.
À ce jour, la dégradation ciblée des protéines est inexplorée chez les plantes. Cela s'explique par l'expansion de la machinerie d'ubiquitination chez les végétaux qui possède plus de 1500 ligases E3 de l'ubiquitine, par l'absence de conservation évidente entre les ligases E3 de plantes et humaines, ainsi que par le manque de ligands synthétiques pertinents pour les ligases E3 végétales.
Nous avons identifié grâce à des analyses bioinformatiques une ligase E3 chez Arabidopsis qui possède une structure tridimensionnelle apparentée à hsCRBN, particulièrement au niveau du domaine de fixation du thalidomide. Des analyses de docking montrent notamment que cette protéine, maintenant appelée AtCRBN, peut accommoder des IMiDs.
Le projet de thèse permettra donc de mieux caractériser la machinerie de dégradation de protéines chez les plantes et d'établir la preuve de concept de la dégradation ciblée à des fins de recherche académique en utilisant CRBN. Caractérisation de l'ubiquitine ligase CRBN d'Arabidopsis et établissement de la preuve de concept pour son utilisation dans la dégradation ciblée des protéines Le projet fera appel à des méthodes de biochimie des protéines (expression/purification de protéines recombinantes, western blot, immunoprécipitation, caractérisation de modification post-traductionnelle, tests enzymatiques), de biophysique (interaction protéine:ligand), de TurboID, de biologie moléculaire (clonage, RT-qPCR, CRISPR, transgénèse, génotypage) et d'imagerie (microscopie confocale, colocalisation, live imaging). Le projet fera aussi appel à la biologie structurale via l'utilisation d'Alphafold.