Thèse Comment la Bactérie Marine Zobellia Galactanivorans Métabolise les Oligosaccharides de Xyloglucanes Étude des Enzymes et Transporteurs H/F

Doctorat.Gouv.Fr

La bactérie marine Zobellia galactanivorans DsijT a été isolée en 2001 à la surface cellulaire d'une macroalgue rouge. Au cours des dernières décennies, elle est devenue un organisme modèle pour la bioconversion des polysaccharides algaux [2, 3, 4]. Des données génomiques et transcriptomiques sont disponibles, ainsi que des outils génétiques permettant de déléter des gènes et/ou de compléter leur fonction. Au cours de la caractérisation d'un PUL original de Z. galactanivorans nous avons ont mis en évidence que bien que Z. galactanivorans ne puisse pas se développer sur le xyloglucane, elle est en réalité capable de se croitre sur ses produits de dégradation c'est à dire des oligosaccharides de xyloglucane. Ceci indique qu'elle ne possède pas d'enzymes capable de dégrader ce polysaccharide à sa surface cellulaire mais qu'elle possède bien des transporteurs capables de transporter les oligosaccharides de xyloglucane ainsi que des enzymes capables de les dégrader au niveau de son périsplasme ou cytoplasme.
Étant donné que le xyloglucane est principalement présent dans la paroi cellulaire des plantes terrestre et peu décrit chez les plantes marines ou les algues, nous cherchons à comprendre pourquoi et comment Z. galactanivorans peut métaboliser les oligosaccharides de xyloglucane. La thèse repose sur l'hypothèse que Z. galactanivorans tire profit de la dégradation préalable des polysaccharides en oligosaccharides par d'autres bactéries présentes sur les plantes marines. Ce comportement souligne l'importance des transporteurs de glycosides et leur rôle dans les stratégies trophiques des bactéries hétérotrophes. La première étape du projet consistera à identifier, par séquençage de l'ARN, les enzymes et le ou les transporteurs susceptibles d'intervenir dans la métabolisation des oligosaccharides du xyloglucane. Les enzymes seront ensuite produites dans E. coli et purifiées afin de procéder à leur caractérisation structurale et fonctionnelle. Leur action synergique sera également évaluée. Nous ferons de la délétion de gènes pour valider le rôle fonctionnel du(es) transporteur(s) identifié(s). Nous tenterons également de purifier les transporteurs directement à partir de la membrane de Z. galactanivorans afin de déterminer leur structure 3D et de mettre au jour les fondements structurels du transport des oligosaccharides. Ces travaux contribueront à identifier des nouvelles protéines pour la valorisation des polysaccharides et ainsi à plus long terme contribuer au développement de la bioéconomie et du développement durable. Polysaccharides and glycans are ubiquitous across all kingdoms of life and are responsible of essential biological functions; uncovering the enzymes and transporters that drive their metabolism is therefore of critical importance.

Coastal marine habitats constitute hotspots of primary productivity. In temperate regions, this is due both to massive phytoplankton blooms and dense colonisation by macroalgae that mostly store carbon as glycans, contributing substantially to local and global carbon sequestration. Because they control carbon and energy fluxes, algae-degrading microorganisms are crucial for coastal ecosystem functions. The role of microorganisms as recyclers of algal biomass is even more relevant in the context of global change, since their action can influence the carbon balance in coastal ecosystems already threatened by human activities and pollution.

Land plant and algae differ in their evolutionary lineages but also in their cell wall composition which reflects their environment constraints. Land plant cell wall contains several polysaccharides such as cellulose, hemicelluloses (e.g. xyloglucan, xylans) and pectins, where cellulose is the main component to ensure rigidity. In algae, the amorphous fraction is dominant, made by typical polysaccharides which are either carboxylic (alginate in brown algae) or sulfated (carrageenan in red algae). These polysaccharides provide several advantages, including flexibility to resist to wave action. Marine plants are basically land plant (among the angiosperms) that went back to live in the ocean. Despite their important ecological role, existing literature is scarce about the adaptation of these angiosperms to the marine environment and on the composition of their cell wall polysaccharides. Also, their biodegradation by heterotrophic bacteria has not been investigated at the molecular level.

Glycoside transporters are key components in the metabolism of heterotrophic bacteria as they provide the cells with permeability and selectivity to grow on defined substrates and contribute to drive microbial ecology. They are also key features in fermentation and synthetic biology. Although transport is a crucial step in the metabolism of glycosides, SusCD characterization stayed in the blind spot until recently. Indeed, among the 81,235 PULs predicted by PULDB [5] (https://www.cazy.org/PULDB/) only three SusCD have been structurally characterized so far [6, 7, 8].

Carbohydrate active enzymes are invaluable biocatalysts regarding the valorization of biomass. Enzymes from marine heterotrophic bacteria have been much less studied compared to enzymes originating from plant-associated bacteria and are thus likely to enrich the catalytic toolbox. Also, high-throughput sequencing has led to the accumulation of genomics and metagenomics data for which functional annotation and experimental validation remain important bottlenecks. This thesis project will characterize novel enzymes for bioconversion of carbohydrates providing new catalysts for bioeconomy. While xyloglucan is one of the most abundant polysaccharides in terrestrial plants it is much less described in marine plants or algea. Therefore, it is not obvious that a marine bacteria is able to metabolise xyloglucan oligosaccharides. The objective in this thesis is to understand why and how the marine bacterium Z. galactanivorans can metabolize xyloglucan oligosaccharides. To do so, the transporters and enzymes involved in xyloglucan oligosaccharides degradation will be identified and characterized. Molecular biology (PCR, cloning, RNAseq)

Microbiology (bacterial cultures, genetics)

Biochemistry (recombinant protein expression, purification, enzymatic kinetics)

Structural biology (cryistallogenesis, crystallography, cryo-EM)