Thèse Ingénierie de Levure Probiotique pour la Santé Humaine et Animale H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse École doctorale : SEVAB - Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingenieries Laboratoire de recherche : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering Direction de la thèse : Hélène MARTIN-YKEN ORCID 0000000220243232 Début de la thèse : 2026-10-01 Date limite de candidature : 2026-06-01T23:59:59 La violacéine, pigment indolique produit naturellement par certaines bactéries, possède des propriétés antimicrobiennes, antitumorales et immunomodulatrices. La darobactine A et ses homologues constituent une nouvelle classe de composés antibiotiques naturels peptidiques synthétisés par les ribosomes et modifiés post-traduction, caractérisés par leur activité à large spectre contre les bactéries pathogènes Gram-négatives. La production naturelle de violacéine et des darobactines est limitée et très 1,2difficile à industrialiser. Nous proposons de développer leur synthèse hétérologue et l'optimisation métabolique dans la levure Saccharomyces cerevsisiae boulardii, hôte probiotiques sûr. Avec l'explosion des outils génétiques modernes, des probiotiques génétiquement modifiés sont conçus chaque semaine, brevetés et leur efficacité en tant que biothérapies vivantes est évaluée dans le monde entier. En Europe, l'utilisation de ces probiotiques OGM est déjà acceptée pour sauver des vies dans le cadre de thérapies compassionnelles. Il est tout à fait logique de développer ces souches pour aider à contrer la résistance aux antibiotiques puisque, même s'ils ne sont pas encore autorisés en tant que probiotiques, ils constituent des châssis sûrs pour produire des composés antimicrobiens à grande échelle. La résistance croissante aux antibiotiques représente une menace très grave pour la santé mondiale, relevant du concept « One Health1 », avec des taux de mortalité et de morbidité très élevés. Selon les projections elle pourrait causer jusqu'à 10 millions de décès par an d'ici 20502, ces pertes humaines étant principalement dues aux bactéries multirésistantes du groupe ESKAPEE. Il devient donc crucial de trouver des stratégies thérapeutiques innovantes. Les composés antimicrobiens (AMC) produits et délivrés in vivo par des souches probiotiques constituent une approche alternative intéressante. La violacéine, pigment indolique produit naturellement par certaines bactéries, possède des propriétés antimicrobiennes, antitumorales et immunomodulatrices »,3,4. La darobactine A et ses homologues constituent une nouvelle classe de composés antibiotiques naturels peptidiques synthétisés par les ribosomes et modifiés post-traduction, caractérisés par leur activité à large spectre contre les bactéries pathogènes Gram-négatives3-5. La production naturelle de violacéine et des darobactines est limitée et très difficile à industrialiser. Nous proposons de développer leur synthèse hétérologue et l'optimisation métabolique dans des hôtes probiotiques sûrs, génétiquement modifiés pour leur permettre de délivrer ces composés dans le tube digestif de patients atteints d'infections potentiellement mortelles causées par des bactéries multirésistantes6,7. En tant que stratégie alternative aux antibiotiques ciblant les espèces bactériennes ESKAPEE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp. et Escherichia coli), nous construirons puis améliorerons des souches probiotiques génétiquement modifiées produisant des AMC sélectionnés (violacéine et darobactine). Nous explorerons l'innocuité et l'efficacité de ces souches contre les bactéries pathogènes, et nous évaluerons leurs effets sur la santé à l'aide de modèles cellulaires et animaux. Les AMC sont largement reconnus pour leur potentiel à inhiber la croissance bactérienne, mais leur production industrielle reste complexe et difficile à optimiser.
Défis scientifique et sociétal : L'utilisation de probiotiques comme « châssis vivants » est une stratégie qui permet de produire et d'administrer ces molécules antimicrobiennes directement in situ, maximisant ainsi leur efficacité tout en réduisant les effets secondaires. De plus, l'application combinée de l'évolution dirigée et de l'ingénierie métabolique offre la possibilité d'améliorer la tolérance des souches aux composés antimicrobiens qu'elles produisent et d'optimiser leur rendement, ouvrant la voie à une production stable adaptée à un usage thérapeutique.
Installer et optimiser la voie de biosynthèse de la violacéine dans Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, levure GRAS et probiotique. Ce travail sera réalisé au laboratoire TBI dans l'équipe I2M Ingénierie Moléculaire et Métabolique. À titre de résultat préliminaire, l'équipe I2M a réussi à intégrer les gènes la voie de biosynthèse de la violacéine dans la souche de laboratoire S. cerevisae CenPK, très proche de son variant boulardii8 (identité génétique supérieure à 99%). Ce dernier présente cependant quelques défis particuliers qui devront être pris en compte aussi bien dans la conception des constructions génétiques à intégrer (notamment l'absence de marqueurs auxotrophiques) que dans la conduite des expérimentations elles-mêmes (température de croissance, protocole de transformation adapté).
Ce projet de recherche met en oeuvre de la biologie moléculaire in silico et pratique, des transformations de levure, des cultures microbiennes, de nombreuses analyses par HPLC et chromatographie gazeuse pour quantifier les intermédiaires et produits finaux de la voie de biosynthèse.
Étant donné que nous cherchons à produire un composé antimicrobien au sein d'un micro-organisme, des problèmes de toxicité des intermédiaires métaboliques ou du produit final peuvent survenir et affecter la croissance ou la production. Ce challenge sera traité de deux manières complémentaires, par conception métabolique innovante et par évolution des souches. Dans le cadre de cette thèse, un second composé antimicrobien est également ciblé, la Darobactine. Il faudra donc intégrer les gènes nécessaires à sa synthèse dans la levure.
L'amélioration des souches obtenues pourra être mise en oeuvre par évolution expérimentale, soit à TBI qui dispose de facilités de fermentations sur le plateau SoFerm, soit en collaboration avec l'unité MICALIS en utilisant le dispositif expérimental ModuloStat9 développé par les équipes SyBER et MaIAGE, qui permet un enrichissement progressif de la culture en cellules les plus résistantes au stress. Dans les deux cas, l'évolution sera conduite soit en augmentant la concentration externe du composé anti-microbien d'intérêt (violacéine ou darobactine) soit en augmentant le niveau de sa biosynthèse à l'aide de promoteurs inductibles modulables. Afin de gérer les risques pour l'environnement, un système de confinement biologique conçu précisément pour cette levure10 sera intégré dans les souches construites afin d'empêcher toute dissémination.
La phase ultime de la thèse sera consacrée à des tests de sécurité et d'efficacité in vitro. Sur des cellules mammifères en culture (Caco2, IPEC), nous évaluerons les effets de la présence de nos souches ou des composés qu'elles produisent sur la viabilité, l'inflammation, la signalisation du stress cellulaire et l'effet barrière des cellules intestinales (par mesures de résistance électrique trans-épithéliale). Nous effectuerons enfin des tests d'inhibition de croissance et de viabilité sur des bactéries pathogènes. Nous envisageons des pathogène modèles d'abord, en conditions de laboratoire adaptées (L2).