Thèse Adaptation Métabolique au Cours des Infections Bactériennes Rôle des Acides Aminés à Chaîne Ramifiée dans la Vie Intracellulaire de Enterococcus Faecalis H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Les acides aminés à chaîne ramifiée (BCAAs), la leucine, l'isoleucine et la valine, jouent un rôle clé dans l'homéostasie métabolique et suscitent, à ce titre, un intérêt croissant en raison de leur potentiel à corriger les déséquilibres métaboliques de l'organisme. Ils interviennent également dans les interactions métaboliques entre l'hôte et les microorganismes ; pourtant, leur rôle dans la réponse aux infections demeure insuffisamment caractérisé. Les BCAAs occupent une place centrale dans la physiologie et la virulence des bactéries pathogènes, car ils peuvent agir à la fois comme métabolites essentiels et comme molécules de signalisation. En particulier, ils modulent l'activité du régulateur transcriptionnel global CodY, qui contrôle l'expression de gènes impliqués dans le métabolisme, l'adaptation au stress et la virulence des bactéries à Gram positif. Enterococcus faecalis est un pathogène opportuniste, responsable d'infections invasives telles que les bactériémies et les endocardites. Sa prolifération intestinale, notamment dans des contextes pathologiques tels que les maladies hépatiques, favorise sa translocation dans la circulation sanguine. Des travaux de l'équipe encadrante ont montré que E. faecalis adopte un mode de vie intracellulaire et est capable de se multiplier au sein des hépatocytes, cellules clés du métabolisme hépatique. Ni les hépatocytes ni E. faecalis ne sont capables de synthétiser de novo les BCAAs. Ce projet vise à comprendre le rôle des BCAAs au cours de l'infection des hépatocytes par E. faecalis. En combinant des approches fonctionnelles, génétiques et multi-omiques (transcriptomique, protéomique, lipidomique), ce travail permettra de disséquer les mécanismes moléculaires reliant la disponibilité des BCAAs, la régulation par CodY et l'adaptation intracellulaire de E. faecalis et la réponse de la cellule infectée. Il vise, à court terme, à décrypter le rôle des BCAAs dans l'infection et leur intégration au dialogue métabolique hôte-pathogène intracellulaire. À plus long terme, il apportera des éléments clés pour évaluer le rapport bénéfice-risque de l'utilisation des BCAAs comme levier thérapeutique dans les maladies transmissibles et non transmissibles.

Les acides aminés à chaîne ramifiée (BCAAs), composés de la leucine, de l'isoleucine et de la valine, jouent un rôle important dans l'homéostasie métabolique des cellules (1). Les BCAAs sont apportés par l'alimentation car les cellules des mammifères ne possèdent pas la voie de biosynthèse permettant leur production de novo. Une fois internalisés, les BCAAs présentent une double fonction, agissant à la fois comme des métabolites essentiels et comme des molécules de signalisation impliquées dans la régulation de divers processus cellulaires. Ils jouent un rôle central dans l'homéostasie énergétique et le métabolisme nutritionnel, en participant à la synthèse protéique et à la production d'énergie (1). Ils agissent également comme molécules de signalisation en régulant notamment le métabolisme du glucose, des lipides et des protéines via les voies PI3K/AKT/mTOR, et contribuent également à la modulation des fonctions des cellules immunitaires (2, 3). Le dysfonctionnement de ces voies contribue au développement du diabète, du cancer et de l'insuffisance cardiaque (1). Cibler les enzymes du catabolisme des BCAAs dans les tumeurs ou rétablir l'homéostasie des BCAAs dans l'insuffisance cardiaque a ouvert de nouvelles perspectives thérapeutiques (4). Les BCAAs sont également impliqués dans des pathologies cataboliques aiguës, traumatiques et inflammatoires telles que le sepsis, les brûlures et la cirrhose, au cours desquelles le catabolisme protéique et énergétique l'emporte sur l'anabolisme, entraînant une dégradation excessive des protéines et des réserves énergétiques (5). Si les tentatives de nutrition parentérale ou par voie intraveineuse se sont avérées peu efficaces, la supplémentation orale de BCAAs est prometteuse dans le traitement de l'encéphalopathie et de la cirrhose (6, 7). Dans un modèle animal de cirrhose, le traitement par les BCAAs réduit l'inflammation hépatique en réduisant la translocation de bactéries du microbiote intestinal et de dérivés bactériens comme les LPS (8). Si la supplémentation en BCAAs est proposée comme levier thérapeutique dans la prise en charge de plusieurs maladies non transmissibles, ses effets sur la réponse aux infections bactériennes ne sont pas caractérisés.

La question du rôle du métabolisme des BCAAs chez les bactéries pathogènes a connu un regain d'intérêt ces dernières années (9-11). Alors que les travaux anciens portaient surtout sur la biosynthèse des BCAAs, des études plus récentes se sont intéressées à leur rôle dans la régulation de la virulence, l'adaptation métabolique in vivo et la compétition nutritionnelle avec l'hôte. Les bactéries pathogènes doivent continuellement ajuster leur métabolisme pour survivre et se multiplier dans les environnements hostiles qu'elles rencontrent au cours de l'infection (12, 13). Cette reprogrammation métabolique constitue un déterminant majeur de l'adaptation bactérienne. Comme chez les cellules eucaryotes, les BCAAs assurent une double fonction chez les bactéries : ils constituent à la fois des métabolites essentiels à leur croissance et des molécules de signalisation leur permettant de s'adapter à leur environnement (14). Les BCAAs sont nécessaires à la synthèse protéique et à la production de composants membranaires, tels que les acides gras à chaîne ramifiée (BCKAs) qui influent sur la fluidité membranaire et la tolérance au stress. Ils participent également à la détection de l'état nutritionnel de l'environnement et à la régulation des gènes de virulence chez certains pathogènes. Certaines bactéries pathogènes sont prototrophes, capables de synthétiser entièrement les BCAAs et donc peu dépendantes de l'hôte (15, 16); mais la plupart sont auxotrophes, ayant perdu tout ou partie de la voie de biosynthèse et dépendantes de transporteurs pour importer les BCAAs de l'hôte. Chez Staphylococcus aureus, bien que les gènes de biosynthèse soient présents, l'acquisition via les transporteurs BrnQ1 et BcaP est privilégiée afin de favoriser la croissance des bactéries dans les macrophages (17, 18, 16). L'approvisionnement en BCAAs chez Francisella tularensis, qui ne possède aucun des gènes de biosynthèse et de catabolisme des BCAAs, dépend uniquement du transporteur IleP et du déclenchement de l'autophagie de l'hôte (19). Chez Streptococcus mutans, l'aminotransférase IlvE contribue à la tolérance acide en redirigeant le flux de pyruvate vers la synthèse de BCAAs, limitant ainsi la production d'acide lactique et neutralisant le pH cytoplasmique par la production d'ammoniac (20, 21). Streptococcus pneumoniae dépend du transporteur ABC LivJHMGF pour sa pathogenèse, son expression augmentant spécifiquement lors de la colonisation du nasopharynx, un environnement pauvre en BCAAs par rapport aux poumons (22, 23). À l'inverse, Pseudomonas aeruginosa utilise une voie catabolique pour consommer les BCAAs de l'hôte (24). Chez plusieurs bactéries pathogènes, telles que Listeria monocytogenes ou S. aureus, les BCAAs modulent directement l'expression de gènes impliqués dans l'invasion, la survie intracellulaire et la virulence via le régulateur transcriptionnel global CodY (25). Le régulateur global CodY agit majoritairement comme répresseur transcriptionnel et son activité dépend de la disponibilité intracellulaire des BCAAs et du GTP. Lorsque les niveaux de cofacteurs sont élevés, CodY maintient la répression de gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés, l'acquisition des nutriments et les réponses au stress. À l'inverse, une diminution de la disponibilité des cofacteurs réduit l'affinité de CodY pour l'ADN et entraîne la dérépression de ses gènes cibles, ce qui permet une adaptation métabolique rapide aux conditions environnementales. Chez L. monocytogenes, CodY joue un rôle unique d'activateur direct du régulateur majeur de la virulence (PrfA) lorsque les niveaux d'isoleucine sont limités, signalant ainsi à la bactérie sa présence dans le cytosol des macrophages (26, 27). Si ces études soulignent l'importance des BCAAs à l'interface hôte-pathogène, la caractérisation de leur rôle dans l'adaptation intracellulaire demeure encore inégalement explorée selon les espèces bactériennes et les types cellulaires infectés.

Cette question prend une dimension nouvelle à la lumière de données remettant en cause le statut strictement extracellulaire de plusieurs bactéries opportunistes, telle que Enterococcus faecalis, et en révélant leur capacité à adopter un mode de vie intracellulaire dans les cellules épithéliales (28). E. faecalis est une bactérie commensale du tube digestif humain, elle est également responsable d'infections opportunistes, notamment chez les patients immunodéprimés. Sa prolifération intestinale favorise sa translocation dans la circulation sanguine (29). Des travaux récents de l'équipe d'accueil ont mis en évidence la capacité de E. faecalis à adopter un mode de vie intracellulaire au sein des hépatocytes (30). Les hépatocytes sont des cellules hautement spécialisées du foie qui jouent un rôle central en tant que véritables « hubs » métaboliques, coordonnant le métabolisme des glucides, des lipides et des acides aminés, tout en participant à la détoxification, aux réponses immunitaires innées et, plus généralement, au maintien de l'équilibre de l'organisme (31). L'environnement intracellulaire des hépatocytes constitue une niche métabolique particulière pour des bactéries intracellulaires, car ces cellules présentent une activité métabolique très riche, une forte disponibilité en nutriments et des mécanismes immunitaires spécifiques, distincts de ceux des cellules immunitaires professionnelles. Les hépatocytes contiennent notamment de nombreuses gouttelettes lipidiques, des organites cytoplasmiques spécialisés dans le stockage des triglycérides et des lipides neutres, qui constituent des réserves énergétiques mobilisables (32). Nous avons mis en évidence que ces gouttelettes lipidiques sont nécessaires à la croissance de E. faecalis dans les hépatocytes (Lecomte et al. en préparation). Nos observations suggèrent également que les triglycérides présents dans les gouttelettes lipidiques des hépatocytes pourraient constituer une source de glycérol exploitable par la bactérie au cours de l'infection. A l'échelle moléculaire, nous avons montré que l'inactivation de codY favorise la multiplication d'E. faecalis dans les hépatocytes, indiquant que ce régulateur contribue au contrôle du mode de vie intracellulaire. Bien que le rôle précis du régulon CodY dans l'infection intracellulaire reste à caractériser, nos résultats suggèrent qu'il intervient notamment dans le contrôle du catabolisme du glycérol. Nous posons l'hypothèse qu'il existe une régulation complexe du mode de vie intracellulaire de E. faecalis, étroitement liée au métabolisme des BCAAs et à la disponibilité des ressources énergétiques dans les hépatocytes. Incapable de synthétiser les BCAAs de novo, E. faecalis dépend, comme la cellule hôte, entièrement de l'environnement pour son approvisionnement de ces acides aminés. Nos résultats préliminaires confirment l'auxotrophie intracellulaire de E. faecalis qui ne se multiplie plus dans les hépatocytes carencés en BCAAs (résultats non publiés). Chez E. faecalis, l'acquisition des BCAAs repose principalement sur des transporteurs de peptides de type ABC appartenant à la famille Opp (33). Deux systèmes, Opp1 et Opp2, permettent l'import d'oligopeptides qui sont ensuite hydrolysés dans le cytoplasme pour libérer les acides aminés essentiels. E. faecalis possède également une voie catabolique permettant de dégrader les BCKAs afin de produire de l'énergie et des précurseurs lipidiques (34, 35). Après transamination, les dérivés -cétoniques sont dégradés par le complexe BKDH codé par l'opéron ptb-buk-bkdDABC. Cette voie permet la production d'ATP par phosphorylation du substrat et joue un rôle dans l'équilibre redox en conditions anaérobies, les acides -cétoniques servant d'accepteurs d'électrons pour la régénération du NAD. L'expression de cette voie est finement régulée : elle est induite par la présence d'acides -cétoniques ramifiés et réprimée par le glucose via un mécanisme de répression catabolique dépendant de CcpA. Si les bases moléculaires de l'acquisition et du catabolisme des BCAAs chez E. faecalis ont été caractérisées in vitro, leur rôle dans un contexte intracellulaire reste à élucider.

L'objectif principal de ce projet est de déterminer le rôle des BCAAs dans l'adaptation intracellulaire de E. faecalis au sein des hépatocytes. Plus précisément, ce projet vise à déterminer comment l'utilisation des BCAAs est répartie entre leurs fonctions métaboliques (synthèse protéique et des lipides membranaires) et leur rôle de signaux régulateurs de l'expression génique bactérienne, notamment via CodY. Il s'attachera également à caractériser le rôle des BCAAs dans la reprogrammation de l'expression génique des cellules hôtes.

Le modèle cellulaire d'infection comprend les hépatocytes humains de la lignée Huh7 qui seront infectés par la souche OG1RF de E. faecalis, souche modèle pour l'analyse de la multiplication intracellulaire de E. faecalis. Le projet de thèse est structuré en trois parties complémentaires pour répondre aux questions suivantes.

1.Les BCAAs et leurs dérivés orchestrent-ils l'adaptation bactérienne et la réponse des hépatocytes au cours de l'infection intracellulaire ? Il s'agira d'analyser le rôle des BCAAs et de leurs dérivés -cétoacides branchés (BCKAs) lors de l'infection des hépatocytes. Contrairement à d'autres types cellulaires, les hépatocytes ont un métabolisme des BCAAs très actif. La bactérie se retrouve donc dans un microenvironnement où les BCAAs libres peuvent être abondants ou limitants. Par ailleurs, les BCAAs, en particulier la leucine, sont connus pour moduler des voies cellulaires majeures telles que mTOR, susceptibles d'influencer la permissivité de la cellule à l'infection. Le catabolisme des BCAAs alimente le cycle de Krebs et régule l'activité mitochondriale ; leur accumulation ou leur mauvaise utilisation peut perturber la respiration, favoriser la production de ROS et conduire à un stress mitochondrial.

Les infections par E. faecalis seront réalisées en milieu carencé ou en milieu supplémenté en BCAAs et en BCKAs. Des expériences combinant l'un ou l'autre des BCAAs seront réalisées afin d'évaluer leurs contributions spécifiques. Le dosage intracellulaire des BCAAs et des BCKAs sera effectué dans les cellules infectées et dans les cellules contrôles. L'impact des conditions de carence ou de supplémentation sur l'adaptation intracellulaire de E. faecalis et la réponse des hépatocytes sera évalué :

Pour étudier le rôle des -cétoacides dérivés des BCAAs dans l'infection par E. faecalis, la délétion de l'opéron bkdDABC, qui code le complexe déshydrogénase des BCKAs, sera réalisée. Cette délétion entraînera un blocage du catabolisme des BCKAs et conduira à leur accumulation dans le cytoplasme. Pour bloquer leur production, la délétion du gène codant la transaminase IlvE sera effectuée. Pour bloquer leur production et leur utilisation, ilvE sera délété dans le mutant bkdDABC. Toutes les souches complémentées seront également construites. Les niveaux de multiplication intracellulaire et de survie des différentes souches seront quantifiés par dénombrement des bactéries intracellulaires. L'efficacité de l'internalisation des bactéries sera également contrôlée.

L'expression de cytokines inflammatoires (comme IL-8 ou TNF-), l'activation de voies de signalisation (mTOR, autophagie) ainsi que les marqueurs de stress cellulaire seront mesurés en particulier le stress mitochondrial dans les différentes conditions.

2.Les BCAAs sont-ils prioritairement utilisés par les bactéries intracellulaires pour la synthèse protéique ou détournés pour la production de lipides membranaires ? Le marquage isotopique de la valine, de l'isoleucine et de la leucine permettra de quantifier leur incorporation dans les protéines bactériennes et d'évaluer leur contribution à la synthèse protéique par protéomique quantitative. Parallèlement, des analyses lipidomiques permettront d'évaluer leur implication dans la biosynthèse des lipides membranaires. L'utilisation d'analogues non métabolisables des BCAAs (ex. norleucine, norvaline) permettra de confirmer leur rôle.

3.Comment les BCAAs reconfigurent-ils les programmes transcriptionnels de la cellule hôte et du pathogène ? Chez E. faecalis, les BCAAs sont les cofacteurs du régulateur transcriptionnel CodY. Le rôle des BCAAs dans la signalisation et la régulation de l'expression des gènes sera étudié par dual transcriptomique en comparant les cellules infectées par la souche sauvage et le mutant codY, en présence ou carence de BCAAs. Des expériences de ChIP-seq seront réalisées afin d'identifier les cibles directes de CodY et établir les liens entre la disponibilité des BCAAs et la régulation transcriptionnelle. Le mutant codY est disponible ainsi que la souche complémentée. Des analyses ciblées d'expression génique et des constructions de souches mutantes ou complémentées permettront de valider les voies régulées par CodY chez E. faecalis. Des approches de perte de fonction chez l'hôte, utilisant CRISPR-Cas9 ou des siRNA, permettront de valider le rôle des gènes eucaryotes identifiés par dual transcriptomique dans la reprogrammation transcriptionnelle induite par les BCAAs et leur impact sur l'infection intracellulaire.