Thèse Caractérisation Biochimique et Enzymatique de Lipoxygénases Eucaryotiques des Études In Vitro à la Fonction Physiologique. H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Bordeaux
École doctorale : Sciences de la Vie et de la Santé
Laboratoire de recherche : Centre de Recherche Paul Pascal
Direction de la thèse : Claire STINES
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-20T23:59:59

L'objectif principal de la thèse sera de produire et purifier des lipoxygénases eucaryotiques (levure, rat/souris ou humaine) en vue de décortiquer leurs mécanismes enzymatiques in vitro, leurs spécificités de substrats et in fine leur mode d'action sur les mitochondries issues de la même espèce. Le sang est rare et précieux et des pénuries sont régulières. Un challenge mondial est la fabrication de sang ex vivo qui pourrait être utilisé pour transfuser des patients. Un postulat de la littérature concerne le rôle de la 15-lipoxygénase humaine dans l'involution mitochondriale lors du passage du réticulocyte à l'érythrocyte au cours de l'hématopoïèse. Des protocoles de production de sang ex vivo sont disponibles dans la littérature, mais un verrou, lors de ce passage des réticulocytes en érythrocytes, empêche d'obtenir des rendements suffisants pour envisager une production de sang à grande échelle destinée aux transfusions des patients. Dans ce cadre, une étude approfondie du rôle de la lipoxygénase in vitro puis sur des systèmes plus complexes est envisagée en vue d'optimiser le protocole de fabrication de sang ex vivo au niveau de la dernière étape de fabrication des érythrocytes. Différents modèles vont être utilisés. Tout d'abord, différentes lipoxygénases de levure, de rat, ou de souris et d'origine humaine seront produites et caractérisées. Différents modes de production seront envisagés allant d'une production hétérologue chez Escherichia coli, Pichia pastoris ou encore in vitro avec des extraits de réticulocytes de lapin afin de disposer d'enzymes pures à homogénéité et en quantité suffisante pour envisager des études de caractérisation enzymatique. Des tests d'activité seront mis au point sur des substrats lipidiques simples, en vésicules de composition lipidique contrôlée, puis sur mitochondries. Une étude par microscopie par force atomique permettra de visualiser les enzymes qui sont de très grande taille seules en solution mais également de suivre leur capacité à former des pores dans la membrane mitochondriale ou des doubles couches lipidiques par formation de complexes de haut poids moléculaire (i.e. la formation d'octamères membranaires par la 15-lipoxygénase humaine). Une caractérisation fine in vitro de différents couples lipoxygénase/substrat lipidique permettra de généraliser ou non un mécanisme enzymatique pour les lipoxygénases étudiées, d'évaluer les quantités minimales d'enzyme nécessaires pour la réalisation de pores dans les membranes. Une approche bottom-up sera utilisée en partant de systèmes modèles minimaux à l'utilisation sur des organites plus complexes, ce qui est un préalable et ce qui permettra d'envisager des études plus poussées pour l'utilisation des lipoxygénases dans des protocoles de fabrication de sang ex vivo.

Le sang est rare et précieux et des pénuries sont régulières. Un challenge mondial est la fabrication de sang ex vivo qui pourrait être utilisé pour transfuser des patients. Un postulat de la littérature concerne le rôle de la 15-lipoxygénase humaine dans l'involution mitochondriale lors du passage du réticulocyte à l'érythrocyte au cours de l'hématopoïèse. Des protocoles de production de sang ex vivo sont disponibles dans la littérature, mais un verrou, lors de ce passage des réticulocytes en érythrocytes, empêche d'obtenir des rendements suffisants pour envisager une production de sang à grande échelle destinée aux transfusions des patients. Dans ce cadre, une étude approfondie du rôle de la lipoxygénase in vitro puis sur des systèmes plus complexes est envisagée en vue d'optimiser le protocole de fabrication de sang ex vivo au niveau de la dernière étape de fabrication des érythrocytes.

L'objectif principal de la thèse sera de produire et purifier des lipoxygénases eucaryotiques (levure, rat/souris ou humaine) en vue de décortiquer leurs mécanismes enzymatiques in vitro, leurs spécificités de substrats et in fine leur mode d'action sur les mitochondries issues de la même espèce.

Différents modèles vont être utilisés. Tout d'abord, différentes lipoxygénases de levure, de rat, ou de souris et d'origine humaine seront produites et caractérisées. Différents modes de production seront envisagés allant d'une production hétérologue chez Escherichia coli, Pichia pastoris ou encore in vitro avec des extraits de réticulocytes de lapin afin de disposer d'enzymes pures à homogénéité et en quantité suffisante pour envisager des études de caractérisation enzymatique. Des tests d'activité seront mis au point sur des substrats lipidiques simples, en vésicules de composition lipidique contrôlée, puis sur mitochondries. Une étude par microscopie par force atomique permettra de visualiser les enzymes qui sont de très grande taille seules en solution mais également de suivre leur capacité à former des pores dans la membrane mitochondriale ou des doubles couches lipidiques par formation de complexes de haut poids moléculaire (i.e. la formation d'octamères membranaires par la 15-lipoxygénase humaine).