Thèse Étude des Changements Conformationnels des Protéines au Cours de la Mécano-Transduction à l'Aide des Microscopies de Polarisation de Fluorescence de Molécule Unique H/F

Doctorat.Gouv.Fr

À l'échelle moléculaire, la mécanotransduction reposerait sur des changements conformationnels des protéines, induits par les forces au sein des sites d'adhésion. Cependant, la manière dont les forces mécaniques modèlent la conformation des protéines le long de l'axe matrice extracellulaire (ECM)-intégrine-taline-actine, et comment ces changements influencent l'architecture, la dynamique et les réponses mécaniques des IAS, reste encore mal comprise. Cette lacune de connaissances provient en grande partie du recours à des approches in vitro indirectes et de l'absence actuelle de techniques capables de quantifier, dans des cellules vivantes, les états conformationnels et/ou mécaniques des protéines.

L'objectif de cette thèse est : (1) d'accéder à la localisation 3D, à la conformation et aux états de tension des protéines individuelles au sein des IAS. En collaboration avec S. Brasselet (Institut Fresnel, Marseille), nous développons une technique de localisation et de suivi de molécule unique qui mesure l'orientation 3D de la molécule au moyen de la polarisation de la fluorescence émise (Senthil Kumar et al, bioRxiv 2025). Combinée aux modalités PALM et sptPALM, techniques bien en place au laboratoire (Rossier et al, Nature Cell Biology 2012 ; Paszek et al, Nature 2014 ; Orré et al, Nature Communications 2021), la stratégie proposée permettra de cartographier au sein des IAS l'orientation des protéines clés (incluant les intégrines et leur ligands de la MEC, ainsi que la taline et l'actine), et de suivre la réponse dynamique des conformations des protéines individuelles en réponse aux forces intra et extracellulaires ; (2) en modifiant activement les niveaux de force exercés sur les IAS à l'aide d'un dispositif d'étirement récemment mis au point en collaboration avec P. Nassoy (LP2N) (Massou Nat Cell Biol. 2020), nous atteindrons une compréhension moléculaire de la mécanotransduction des intégrines.
Les sites d'adhésion cellulaire (IAS) sont des structures macromoléculaires complexes formant le lien physique entre la cellule et le milieu extracellulaire (MEC). Y connaitre l'organisation spatiale des protéines, leur état de connexions et leur dynamique est nécessaire pour déchiffrer comment ces complexes macromoléculaires remplissent leurs fonctions biologiques. L'une d'entre elles, la mécanotransduction par les récepteurs intégrines, convertit les forces mécaniques et les signaux provenant de la MEC en signaux biochimiques et est impliqué de manière critique dans de nombreux processus cellulaires comme l'adhésion, la migration jusqu'à la différentiation des cellules.

À l'échelle moléculaire, la mécanotransduction reposerait sur des changements conformationnels des protéines, induits par les forces au sein des sites d'adhésion. Cependant, la manière dont les forces mécaniques modèlent la conformation des protéines le long de l'axe matrice extracellulaire (ECM)-intégrine-taline-actine, et comment ces changements influencent l'architecture, la dynamique et les réponses mécaniques des IAS, reste encore mal comprise. Cette lacune de connaissances provient en grande partie du recours à des approches in vitro indirectes et de l'absence actuelle de techniques capables de quantifier, dans des cellules vivantes, les états conformationnels et/ou mécaniques des protéines.
L'objectif de cette thèse est : (1) d'accéder à la localisation 3D, à la conformation et aux états de tension des protéines individuelles au sein des IAS. En collaboration avec S. Brasselet (Institut Fresnel, Marseille), nous développons une technique de localisation et de suivi de molécule unique qui mesure l'orientation 3D de la molécule au moyen de la polarisation de la fluorescence émise (Senthil Kumar et al, bioRxiv 2025). Combinée aux modalités PALM et sptPALM, techniques bien en place au laboratoire (Rossier et al, Nature Cell Biology 2012 ; Paszek et al, Nature 2014 ; Orré et al, Nature Communications 2021), la stratégie proposée permettra de cartographier au sein des IAS l'orientation des protéines clés (incluant les intégrines et leur ligands de la MEC, ainsi que la taline et l'actine), et de suivre la réponse dynamique des conformations des protéines individuelles en réponse aux forces intra et extracellulaires ; (2) en modifiant activement les niveaux de force exercés sur les IAS à l'aide d'un dispositif d'étirement récemment mis au point en collaboration avec P. Nassoy (LP2N) (Massou Nat Cell Biol. 2020), nous atteindrons une compréhension moléculaire de la mécanotransduction des intégrines. Nous utiliserons une large gamme d'approches expérimentales à l'interface entre la Biologie cellulaire, la Biophysique, la Physico-chimie et l'Optique:
1/ De l'imagerie photonique couplant techniques de super-résolution et de suivi de protéines individuelles avec les techniques d'analyse de la polarisation de la fluorescence émise.
2/ Des cultures de lignées cellulaires dans lesquelles nous contrôlerons l'expression d'intégrines spécifiques et de leurs régulateurs associés par la technique d'édition génomique par la stratégie CRISPR/Cas9.
3/ Des techniques de chimie de surface pour nano-décorer (nano-patterning) des substrats innovants, compatibles avec l'imagerie super-résolutive et le suivi de protéines individuelles, avec lesquels on pourra mimer les différents paramètres physiques de la MEC (densité et mobilité des molécules bio-adhésives, rigidité)
4/ De l'optogénétique pour contrôler avec la lumière la contractilité des cellules vivantes
5/ Des techniques de biophysique dont un dispositif d'étirement récemment mis au point en collaboration avec P. Nassoy (LP2N), permettant l'utilisation des techniques de microscopie de super-resolution tout en étirant les cellules observées (Massou Nat Cell Biol. 2020).

We will use a wide range of experimental approaches at the interface between Cell Biology, Biophysics, Physical Chemistry and Optics:
1/ Super-resolution photonic imaging and tracking of individual proteins combined to techniques analyzing the optical polarization of emitted fluorescence
2/ Cell line cultures in which we will control the expression of specific integrins and their associated regulators by genome editing using the CRISPR/Cas9 strategy.
3/ Surface chemistry techniques for nano-patterning of innovative substrates, compatible with super-resolutive imaging and tracking of individual proteins, with which we will be able to mimic the different physical parameters of the ECM (density and mobility of bio-adhesive molecules, rigidity)
4/ Optogenetics to control with light the contractility of living cells
5/ Biophysical techniques including a stretching device recently developed in collaboration with P. Nassoy (LP2N), allowing the use of super-resolution microscopy techniques while stretching the observed cells (Massou Nat Cell Biol. 2020).