Thèse Régulation du Métabolisme des Triglycérides par les Protéines Inositol-Requiring Enzyme 1 en Réponse au Stress chez Arabidopsis Thaliana H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université Paris-Saclay GS Biosphera - Biologie, Société, Ecologie & Environnement, Ressources, Agriculture & Alimentation
École doctorale : Sciences du Végétal : du gène à l'écosystème
Laboratoire de recherche : IJPB - Institut Jean-Pierre Bourgin-Sciences du Végétal
Direction de la thèse : Jean-Luc CACAS ORCID 0000000289614505
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-05-06T23:59:59

Chez les cellules eucaryotes, le stress du réticulum endoplasmique (RE), caractérisé par l'accumulation de protéines mal repliées dans la lumière de l'organite, active une voie de signalisation rétrograde, nommée Unfolded Protein Response (UPR). Chez Arabidopsis thaliana, cette voie repose notamment sur les protéines INOSITOL-REQUIRING ENZYME 1A (IRE1A) et INOSITOL-REQUIRING ENZYME 1B (IRE1B), dont l'activité ribonucléase permet l'activation du facteur de transcription bZIP60 et la dégradation ciblée d'ARNm associés au RE via le processus RIDD (Regulated IRE1-Dependent Decay). Si l'UPR est bien caractérisée pour son rôle dans l'homéostasie protéique, son implication dans la régulation du métabolisme lipidique reste encore peu explorée chez les plantes. Des travaux préliminaires ont montré qu'un stress chronique du RE induit chimiquement provoque une accumulation de triglycérides (TAG) dans les parties aériennes et racinaires d'A. thaliana, un phénotype fortement exacerbé chez les doubles mutants ire1a ire1b. Ces résultats suggèrent un rôle central des protéines IRE1 dans le contrôle négatif de l'accumulation des TAG, indépendamment du facteur de transcription bZIP60. Ce projet doctoral vise donc à élucider les mécanismes moléculaires reliant le stress du RE au métabolisme des TAG. Il testera l'hypothèse selon laquelle le processus RIDD limite l'accumulation des TAG en contrôlant leur synthèse et/ou leur dégradation par lipophagie. Enfin, ces régulations seront explorées dans des contextes de stress abiotiques pertinents (stress thermique, salin et carence minérale), afin d'évaluer leur contribution aux mécanismes d'acclimatation des plantes.

Lorsque l'homéostasie du réticulum endoplasmique (RE) est perturbée, des protéines mal repliées peuvent s'accumuler dans la lumière de l'organite. Cette situation est nommée stress du RE. Elle peut être induite chimiquement ou en réponse à des contraintes biotiques et abiotiques chez les plantes et les animaux. Elle conduit à l'activation de la voie Unfolded Protein Response (UPR), une voie de signalisation rétrograde dont l'initiation repose sur la relocalisation de facteurs de transcription (FT) du RE vers le noyau. Chez Arabidopsis thaliana, qui est notre modèle d'étude, la voie UPR canonique (en référence aux modèles animaux) implique trois FT membranaires de la famille basic leucine zipper: bZIP17, bZIP28 et bZIP60. Alors que bZIP17 et bZIP28 transitent via le système sécrétoire précoce pour être activés par clivage protéolytique au sein de l'appareil de Golgi avant de rejoindre le noyau [1,2], bZIP60 est rendu cyto-soluble par un autre mécanisme. Son activation repose sur l'épissage non-conventionnel du dernier intron de son ARNm par les protéines INOSITOL-REQUIRING ENZYME-1 (IRE1), qui sont présentes dans la membrane du RE. L'élimination de cet intron occasionne un changement de cadre de lecture, se traduisant par une protéine bZIP60 plus courte et dépourvue de son domaine transmembranaire [3,4]. Les remaniements transcriptionnels occasionnés par la relocalisation de ces trois FT permettent d'augmenter la capacité de repliement en polypeptides du RE par néosynthèse de chaperonnes. L'activité ribonucléase des protéines IRE1A et IRE1B peut aussi être employée pour dégrader les ARNm associés au RE, un phénomène connu sous le nom de Regulated-IRE1-dependent decay of mRNA (RIDD) [5]. Ce dernier réduit la translocation co-traductionnelle des polypeptides naissants au niveau du RE et limite ainsi la suraccumulation de protéines mal repliées dans l'organite.
Chez les mammifères et la levure, la voie UPR contrôle aussi le métabolisme des lipides. Peu d'informations sont cependant disponibles à l'heure actuelle sur la conservation de ces régulations chez les plantes. Dans le cadre de la thèse de doctorat d'Amélie Ducloy [6], nous avons démontré que la perturbation de la glycosylation des protéines par la tunicamycine (Tm, un antibiotique d'origine bactérienne) cause un stress chronique du RE chez A. thaliana. Ce stress promeut l'accumulation de triglycérides (TAG) dont la composition varie entre les parties aériennes (PA) et racinaires (PR) des plantules. Des approches de génétique fonctionnelle ont révélé un rôle majeur des protéines IRE1 dans la régulation du métabolisme des TAG (données non publiées).
Dans des plantules sauvages subissant un stress chronique du RE, nous avons mis en évidence une accumulation de TAG. Ce phénotype lipidique est très fortement exacerbé dans les PA et les PR d'un double mutant ire1a ire1b en conditions de stress alors que les mutants knock-out bzip60 présentent un phénotype sauvage. Cette suraccumulation de TAG peut par ailleurs être révertée par complémentation fonctionnelle à l'aide du gène IRE1A ou IRE1B [6]. Nos travaux basés sur une approche transcriptomique [7] suggèrent aussi qu'un processus RIDD est à l'oeuvre dans les PA et les PR des plantules sauvages traitées à la Tm. L'ensemble de ces résultats nous a amené à émettre l'hypothèse qu'un phénomène RIDD contrôlerait négativement l'accumulation de TAG induite par un stress du RE en limitant leur synthèse (Fig. 1, Axe 1) et/ou en activant leur dégradation (Fig. 1, Axe 2).
Axe 1 - Contrôle de la synthèse des triglycérides par un processus RIDD. Dans les tissus végétatifs d'A. thaliana, il existe deux enzymes majeures impliquées dans la production de TAG. Il s'agit des protéines DIACYLGLYCEROL ACYL-TRANSFERASE 1 (DGAT1) et PHOSPHOLIPIDE-DIACYLGYCEROL ACYL-TRANSFERASE 1 (PDAT1) [8]. Pour tester l'hypothèse que l'une et/ou l'autre de ces deux enzymes contribue(nt) à la synthèse de TAG en réponse à la Tm (Fig. 1), nous avons généré les triples mutants dgat1 ire1a ire1b et pdat1 ire1a ire1b et toutes les combinaisons de doubles mutants correspondants. Ces mutants et les simples mutants correspondant seront phénotypés pour leur sensibilité à la Tm par mesure de la matière fraîche des PA et PR, et de la longueur de la racine primaire. Un lipidome sera réalisé par UHPLC-MS² sur les PA et les PR d'un set restreint de mutants sélectionnés en fonction des résultats de phénotypage. La possibilité que les ARNm DGAT1 et PDAT1 puissent être dégradés par RIDD sera également évaluée par RT-qPCR. Pour cela, l'actinomycine D, qui est un inhibiteur de la transcription, sera employée en combinaison avec la Tm pour amplifier les potentielles différences de niveaux de transcrits entre tissus WT et mutants ire1a ire1b. L'inactivation de la transcription par l'actinomycine D, associée à un phénomène RIDD, est en effet censée faire chuter les niveaux d'ARNm d'une cible RIDD chez des plantules WT comparativement à un double mutant ire1a ire1b [5]. Des lignées ire1a ire1b transformées avec des versions mutantes IRE1A ou IRE1B, permettant l'expression de protéines dépourvues de leur activité ribonucléase [9], seront également étudiées pour confirmer ce jeu de données. Les doubles mutants complémentés avec les versions WT IRE1A ou IRE1B sont disponibles au laboratoire et seront utilisés comme témoins. En cas de validation de notre hypothèse pour l'un des deux gènes, une dégradation directe des transcrits pourra être mise en évidence par Northern blot.
Axe 2 - Contrôle de la dégradation des triglycérides par un processus RIDD. Il est connu que certaines cibles RIDD codent des protéines inhibitrices de l'autophagie [10]. Or, on sait que l'autophagie peut être induite par la Tm [11], et participer à la dégradation des corps lipidiques cytoplasmiques chez A. thaliana [12], un phénomène nommé lipophagie. Dans notre système expérimental, il est donc possible que l'accumulation des TAG chez des plantules stressées soit limitée par un processus de lipophagie, lequel serait sous le contrôle du RIDD (Fig. 1). Pour tester cette hypothèse, nous commencerons par mettre en évidence l'activité autophagique et étudier sa cinétique en réponse à la Tm dans les PA et les PR, en quantifiant l'apparition d'autophagosomes par microscopie confocale et en utilisant des outils biochimiques (Western Blot) pour détecter les protéines ATG8 impliquées. Pour cela, nous disposons de lignées pActin:GFP-ATG8a ou pActin:GFP-ATG8f dans un fond génétique WT. La possibilité que le RIDD puisse contrôler les flux autophagiques sera étudiée en utilisant les mêmes constructions dans des mutants simples bzip60, ire1a, ire1b et doubles ire1a ire1b. L'ensemble de ces données sera confirmé par quantification de l'expression des gènes ATG8 (RT-qPCR). D'autre part, le lien entre la dégradation des TAG et l'activité autophagique sera établi en quantifiant les niveaux de lipides dans des mutants nuls atg5 et atg7 déficients pour l'autophagie. La production et l'étude par une approche lipidomique des triple mutants atg5 ire1a ire1b et atg7 ire1a ire1b, s'ils sont viables, pourra venir compléter notre démonstration. Enfin, la quantification du phénotype développemental (matière fraîche, longueur de la racine primaire, cf. Axe 1) de tous ces mutants nous renseignera indirectement sur le rôle de la remobilisation des TAG dans la tolérance au stress du RE.
Axe 3 - Régulation et rôle du métabolisme des TAG en réponse aux stress abiotiques. Dans la littérature, un stress chimique a très souvent été utilisé pour perturber l'homéostasie du RE, même si on sait que nombre de stress abiotiques sont capables d'activer la branche IRE1-bZIP60 chez A. thaliana [13]. Parmi ceux-ci, les stress thermiques, salins et les carences minérales sont aussi connus pour occasionner un remodelage transitoire du métabolisme lipidique, incluant la synthèse de TAG et la formation de corps lipidiques [14-16]. Dans ce dernier volet de la thèse, qui sera plus exploratoire, nous testerons donc l'hypothèse que les réseaux de régulation étudiés dans les Axes 1 et 2 soient parties prenantes dans les réponses d'acclimatation au choc thermique, au stress salin et à une carence en soufre. Le matériel génétique et les approches utilisés dans les deux premiers axes seront remobilisés à la fois pour appréhender l'origine des TAG dans la tolérance à ces stress, mais également pour discriminer les rôles respectifs de la voie UPR et des ajustements lipidiques dans cette tolérance.

L'objectif de ce projet doctoral est double : (i) comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine de l'accumulation des TAG dans les PA et les PR de plantules d'A. thaliana subissant un stress chronique du RE induit chimiquement (Axes 1 et 2), et (ii) transposer ces connaissances à des conditions de stress abiotiques (Axe 3).

Ce projet se fera dans la continuité de la thèse d'Amélie Ducloy. Il bénéficiera donc des données obtenues à cette occasion [6,7], de l'expertise du groupe et du matériel disponible au laboratoire. Ainsi, le système expérimental pour induire un stress du RE chez des plantules cultivées in vitro en conditions contrôlées et récolter séparément les PA et les PR a déjà été mis au point et caractérisé [7]. Nous avons également mis au point avec la plateforme chimie-métabolisme de l'IJPB l'extraction et le dosage de lipides par UHPLC-MS² (approche non ciblée).