Thèse Crispr Interference chez Streptococcus Agalactiae Identification des Gènes Essentiels à la Colonisation et à la Virulence H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Établissement : Université de Tours
École doctorale : Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant - SSBCV
Laboratoire de recherche : ISP - Infectiologie et Santé publique
Direction de la thèse : Philippe LANOTTE ORCID 0000000299935548
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-04-27T23:59:59

Streptococcus agalactiae est un pathogène opportuniste responsable d'infections néonatales sévères et d'infections animales. Sa capacité à coloniser divers hôtes reflète une grande plasticité génétique encore mal comprise. Ce projet vise à optimiser un système de CRISPR interférence (CRISPRi) chez S. agalactiae, permettant une répression génique spécifique et réversible via une dCas9 associée à des ARN guides. Trois axes structureront le travail : (i) optimisation du CRISPRi dans une souche de référence, puis extension à des souches cliniques humaines et animales ; (ii) criblage génomique à grande échelle en conditions de stress et en modèles d'infection pour identifier les gènes impliqués dans la survie, l'adaptation et la virulence ; (iii) validation fonctionnelle et analyses transcriptomiques pour caractériser les réseaux de régulation. Ce projet établira un cadre expérimental robuste pour décrypter les déterminants génétiques d'adaptation et de virulence, identifier de nouvelles cibles antibactériennes et fournir un outil transférable à d'autres contextes pathogéniques.

Streptococcus agalactiae est une bactérie pathogène opportuniste responsable d'infections néonatales sévères (Seale et al., 2017), d'infections invasives chez l'adulte (Vuillemin et al., 2021), ainsi que d'infections animales. Sa capacité à coloniser des hôtes variés (humains, bovins, poissons) témoigne d'une plasticité génétique et physiologique remarquable, encore insuffisamment comprise. L'identification des déterminants moléculaires impliqués dans la colonisation, l'adaptation et la virulence constitue un enjeu majeur en infectiologie, en partie pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
L'étude fonctionnelle des gènes essentiels demeure limitée par la létalité induite par les approches classiques de délétion. La technologie CRISPR interference (CRISPRi), reposant sur une enzyme dCas9 catalytiquement inactive associée à des ARN guides (sgRNA), permet une répression transcriptionnelle spécifique, modulable et réversible (Qi et al., 2013). Couplée aux techniques de séquençage à haut débit, elle autorise le criblage de génomes entiers (Rousset et al., 2018), dans des conditions variées. Deux études récentes ont démontré la faisabilité de la CRISPRi chez S. agalactiae (Cutts et al., 2025; Firestone et al., 2025), validant le principe de la répression ciblée dans cette espèce. Toutefois, ces travaux restent limités à des contextes expérimentaux restreints et n'explorent pas systématiquement les réseaux d'adaptation en conditions physiologiquement pertinentes.
Ces éléments nous ont mené aux hypothèses de travail suivantes : (i) des gènes essentiels ou conditionnels impliqués dans l'adaptation ou la virulence échappent aux approches classiques de délétion, mais peuvent être révélés par CRISPRi-Seq ; (ii) l'adaptation de S. agalactiae à des environnements variés repose sur un réseau génique complexe et dynamique, identifiable par criblage multi-conditions ; (iii) l'intégration des données issues des criblages CRISPRi-seq (fitness), des analyses transcriptomiques et des phénotypes in vivo, via des analyses bio-informatiques robustes, permettra de révéler des noeuds régulateurs centraux orchestrant l'adaptation et la virulence de S. agalactiae, constituant ainsi de potentielles cibles thérapeutiques.

Le travail se structurera en trois axes complémentaires : (i) optimiser et adapter un système CRISPRi robuste et modulable chez différentes souches de S. agalactiae ; (ii) réaliser un criblage génomique conditionnel à grande échelle afin d'identifier les gènes impliqués dans la survie, la colonisation ou la virulence ; (iii) valider fonctionnellement les gènes candidats et caractériser les réseaux de régulation associés.

WP 1 : Mise en place et optimisation du système CRISPRi chez S. agalactiae
Les mutations D10A et H845A nécessaires à l'inactivation catalytique de Cas9 ont été identifiées (Gopalakrishna et al., 2023) et validées chez S. agalactiae (Cutts et al., 2025; Firestone et al., 2025). Toutefois, aucun de ces travaux n'a intégré de promoteur inductible pour contrôler finement l'activité de dCas9, ni proposé d'insertion chromosomique des guides, ce qui pourrait constituer des pistes d'optimisation (Knoops et al., 2022). Nos données préliminaires (Pastuszka et al., 2025) montrent que l'expression de cas9 est finement régulée chez S. agalactiae, suggérant qu'un système constitutif optimisé pourrait suffire, ce qui serait particulièrement avantageux pour des études in vivo, où l'utilisation d'inducteurs chimiques est contraignante. Le système sera d'abord développé sur une souche de référence, puis étendu à des souches cliniques et animales, incluant celles associées aux infections chez le poisson, alors que les études actuelles se limitent à une souche unique. Afin de valider la robustesse et la reproductibilité du système, des guides seront d'abord conçus pour cibler des gènes témoins dont l'impact sur la croissance ou la virulence est bien documenté. Ces expériences serviront de preuve de concept avant d'appliquer la technologie à des criblages à large échelle. Ce travail sera conduit en collaboration avec l'équipe du Pr Moineau (Université Laval, Québec), experte dans l'étude des systèmes CRISPR des streptocoques.
WP 2 : Criblage génomique (CRISPRi-seq) et identification de gènes essentiels
La puissance de la technologie CRISPRi réside dans sa capacité à cibler simultanément plusieurs gènes grâce à la distribution des motifs PAM dans le génome. Le génome de S. agalactiae ( 2200 gènes) contient plus de 140 000 PAM, rendant théoriquement chaque gène accessible. Une librairie de guides couvrant le génome complet sera générée, permettant un criblage à large échelle. Les expériences porteront sur des conditions de stress in vitro (oxydatif, nutritionnel), en coculture avec des bactéries représentatives du microbiote vaginal, et en modèles murins de colonisation et d'infection déjà établis (Aznar et al., 2024), en collaboration avec le Pr Tazi (Institut Cochin, Paris). L'analyse des variations d'abondance des sgARN, réalisée en collaboration avec le Dr Mazzuoli (Veening Lab, Université de Lausanne), permettra d'identifier les gènes essentiels et conditionnels impliqués dans la survie, l'adaptation et la virulence.
WP 3 : Validation fonctionnelle et analyses transcriptomiques
Les gènes candidats identifiés seront validés individuellement par des répressions ciblées et des analyses transcriptomiques (RNA-seq). L'utilisation d'outils complémentaires comme les systèmes CRISPRa (activation) ou les anti-CRISPRs permettra d'explorer finement les mécanismes de régulation et de mettre en évidence des gènes dont la modulation différentielle influence directement l'adaptation bactérienne.