Thèse Exploration de la Glycosylation des Vésicules Extracellulaires Via une Plateforme Microfluidique Intégrée H/F

Université Paris-Saclay GS Chimie

Établissement : Université Paris-Saclay GS Chimie
École doctorale : Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes
Laboratoire de recherche : Institut Galien Paris-Saclay
Direction de la thèse : Myriam TAVERNA ORCID 0000000236568293
Début de la thèse : 2025-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-31T23:59:59

Les Vésicules Extracellulaires (VEs) sont des nanoparticules (30-500 nm) délimitées par une membrane phospholipidique, sécrétées par différents types de cellules et présentes dans la plupart des fluides biologiques d'un organisme vivant (sang, urine, lait...). En plus d'être considérées comme sources de biomarqueurs pour diverses pathologies, les VEs se révèlent très prometteuses comme nanovecteurs thérapeutiques d'origine biologique. Les oligosaccharides, présents à leur surface, interviennent dans divers processus biologiques in vivo tels que leur biodistribution, leur interaction et internalisation par les cellules cibles. Ce projet vise à développer une plateforme analytique innovante, couplant la microfluidique de gouttes et l'électrophorèse capillaire (EC), pour l'analyse de la glycosylation des VEs et mieux comprendre le rôle de cette glycosylation dans le devenir in vivo. La technologie de gouttes microfluidiques, exploite des pinces magnétiques et des billes magnétiques fonctionnalisées (COOH-, anticorps...) permettant de transporter les molécules/particules d'intérêts d'une goutte à une autre, et ainsi de réaliser un traitement de l'échantillon biologique multi-étapes automatisé (4). Cette technologie a été récemment mise au point au laboratoire pour le traitement d'échantillons de glycoprotéines purifiées en vue d'une analyse glycomique (5) ou pour isoler avec de meilleurs rendements des EVs (6). L'aspect innovant du projet réside dans la mise au point d'un système en microfluidique de gouttes pour la préparation d'échantillons plus complexes, tels que les VEs contenues dans les fluides biologiques, intégrant plusieurs étapes de traitement (isolement des VEs, traitements enzymatiques, marquage des oligosaccharides...) indispensable à l'analyse en aval de leur profil de glycosylation. Cette dernière sera réalisée en partant d'une méthode d'analyse par électrophorèse capillaire couplée à une détection fluorescente (EC-LIF), déjà implémentée au laboratoire (7) mais qui devra être optimisée et améliorée. Une fois mis au point, le traitement d'échantillons et l'analyse par EC-LIF seront réalisés en ligne en développant une interface de couplage entre un système de gouttes microfluidiques et l'EC digitale. Cette plateforme intégrée sera ainsi exploitée pour évaluer l'impact de facteurs exogènes et endogènes (conditionnement cellulaire durant la production de VEs, traitements chimiques/physiques appliqués aux échantillons...) sur la glycosylation de modèles de VEs destinées à l'encapsulation d'agents thérapeutiques. Des études in vitro seront également menées pour explorer l'influence du profil de glycosylation des VEs sur leurs propriétés fonctionnelles et thérapeutiques en tant que nanovecteurs (ex : internalisation par les cellules cibles...) en utilisant différents modèles de cultures cellulaires.

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des nanoparticules (30-500 nm) sécrétées par toutes les cellules (eucaryotes et procaryotes). Ce sont des acteurs clés de la communication intercellulaire ; elles transportent divers cargos moléculaires (protéines, lipides, ARN...) entre cellules, et leur composition biomoléculaire reflète l'état physio-pathologique de leur cellule d'origine (1). Les VEs sont ainsi considérées comme sources de biomarqueurs accessibles par biopsie liquide pour diverses pathologies (cardiovasculaires, cancer...). De plus, leur capacité à franchir les barrières biologiques, à cibler des cellules réceptrices spécifiques pour y délivrer leur contenu et à encapsuler divers agents exogènes ou molécules actives (petites molécules, ARN...) en fait également des nanovecteurs prometteurs pour des applications thérapeutiques. Les VEs présentent une grande hétérogénéité en composition en raison de leurs origines cellulaires variées et leurs divers modes de biogenèse. Parmi leurs composants, les VEs sont riches en glycoconjugués (glycoprotéines et glycolipides), localisés dans leur cargo et leur membrane phospholipidique. La glycosylation, une des modifications post-traductionnelles essentielles des protéines, joue un rôle clé dans divers processus physiopathologiques et notamment l'interaction entre cellules et la signalisation cellulaire. Des études récentes ont montré une glycosylation aberrante de VEs associée à l'apparition et la progression de diverses pathologies (cancer, maladies neurodégénératives...). D'autres travaux ont mis en évidence l'impact des structures oligosaccharidiques présentes à la surface des VEs sur leur interaction avec les cellules réceptrices et sur leur biodistribution in vivo (2,3). L'étude de la glycosylation des VEs offre ainsi de nouvelles perspectives pour leur exploitation comme nanovecteurs de médicaments mais aussi pour la découverte de nouveaux biomarqueurs diagnostiques. Cependant, l'analyse de la glycosylation des VEs représente un défi analytique majeur que nous souhaitons relever, du fait de l'hétérogénéité des VEs (en taille, composition), leur présence dans des matrices biologiques complexes et de la grande diversité des structures oligosaccharidiques. De plus, cette analyse requiert de nombreuses étapes préalables de préparation d'échantillons, non seulement longues, mais peu efficaces et difficilement reproductibles. Ainsi le projet de thèse consiste à développer une plateforme analytique capable d'automatiser l'ensemble des étapes de traitement d'échantillons biologiques jusqu'à la caractérisation fine et sélective de la glycosylation de VEs.

.-Mettre au point une approche analytique innovante et puissante, basée sur le couplage entre la microfluidique de gouttes et l'analyse par électrophorèse capillaire, pour caractériser finement le profil de glycosylation des vésicules extracellulaires.
-Exploiter la plateforme ainsi développée pour étudier l'impact de divers facteurs, endogènes (conditionnement des cellules en culture durant la production des VEs) et exogènes (méthodes utilisées pour isoler/purifier les VEs, traitements physiques/chimiques de l'échantillon....) sur le profil de glycosylation des VEs destinées à des usages thérapeutiques.

-Développement du traitement d'échantillon biologique en microfluidique de gouttes intégrant différentes étapes telles que la capture des VEs par billes magnétiques, traitements enzymatiques, libération des structures oligosaccharidiques d'intérêt, etc.
-Analyse des oligosaccharides libérés des VEs par Électrophorèse Capillaire avec une détection fluorescente (EC-LIF).
-Couplage en ligne des étapes de traitement d'échantillons et de l'analyse de la glycolysation par EC-LIF à l'aide d'un système unique intégrant la microfluidique de gouttes et l'EC.
-Caractérisation physico-chimique complémentaire des VEs à l'aide de techniques conventionnelles (Nanoparticle Tracking Analysis NTA, diffusion de lumière DLS, Western-blot...).
-Exploration de l'impact du profil de glycosylation des VEs sur leurs propriétés fonctionnelles et thérapeutiques in vitro sur culture cellulaire (interaction et internalisation par les cellules cibles, capacité à induire un changement dans les cellules réceptrice...). Pour cela, différentes techniques d'analyse cellulaire seront utilisées (test de viabilité cellulaire, cytométrie en flux, imagerie confocale...).