Thèse Optimisation du Système Pace à Bacillus Subtilis pour l'Évolution Dirigée Continue de Protéines H/F

Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : MICALIS- Microbiologie de l'Alimentation au service de la santé humaine
Direction de la thèse : Etienne DERVYN ORCID 0000000277329491
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

Contexte et état de l'art
Le PACE (Phage-Assisted Continuous Evolution) est une méthode d'évolution dirigée continue permettant de sélectionner des variants protéiques présentant une fonction d'intérêt. Elle repose sur le couplage entre l'activité de la protéine à faire évoluer et la propagation d'un phage, afin de créer une pression de sélection. Actuellement, cette technologie a été développée chez Escherichia coli à l'aide du phage M13. Toutefois, les caractéristiques biologiques spécifiques de ce phage tempéré limitent fortement l'extension du PACE à d'autres organismes, restreignant ainsi son utilisation à un contexte cellulaire unique.
Le développement du PACE dans d'autres bactéries modèles permettrait d'élargir considérablement le champ d'application de l'évolution dirigée continue, notamment pour l'ingénierie de réseaux de régulation ou de capteurs moléculaires (transmenbranaire) fonctionnant dans des environnements physiologiques différents. Bacillus subtilis (et le phage SPP1) constitue un hôte de choix, du fait de sa biologie bien caractérisée, de son importance industrielle et de la disponibilité de nombreux outils génétiques (collaboration avec P. Tavares).
Résultats préliminaires
Un système analogue au PACE a été développé chez B. subtilis en utilisant le phage lytique SPP1. Les gènes phagiques essentiels gp6 et gp7 ont été placés sous le contrôle d'un promoteur faiblement reconnu par le facteur sigma D. Un phage SPP1 délété de ces gènes et portant le gène sigD a permis de sélectionner des variants capables d'activer ce promoteur. Ces résultats démontrent la faisabilité d'un système de PACE fonctionnel chez B. subtilis. Néanmoins, les analyses génomiques indiquent que la sélection favorise principalement une surexpression de D plutôt que l'évolution de la protéine vers une reconnaissance du promoteur, soulignant la nécessité d'optimiser la stringence et la dynamique évolutive du système.
Objectifs du projet de thèse
L'objectif général de cette thèse est d'optimiser et de fiabiliser un système de PACE chez B. subtilis, afin de le rendre plus rapide, plus stringent et adaptable à différents types de fonctions biologiques. Le projet s'articule autour de deux axes principaux.
Axe 1 : Optimisation du système PACE
Le premier axe vise à améliorer la compréhension de la biologie du phage SPP1 dans des conditions de propagation continue. La stabilité génomique du phage et les mécanismes de mutagenèse seront étudiés à l'aide de séquençages à courts et longs fragments, permettant d'identifier d'éventuels réarrangements génomiques et des modes de réplication alternatifs. En parallèle, un système de mesure du taux de mutation sera développé afin de contrôler et d'optimiser la dynamique évolutive du PACE.
Un second volet consistera à renforcer la pression de sélection par la mise en place d'un système de contre-sélection générique. Celui-ci reposera sur l'expression conditionnelle d'allèles toxiques des gènes phagiques essentiels, permettant l'élimination rapide des variants non optimaux et orientant plus efficacement l'évolution vers les fonctions recherchées.
Axe 2 : Validation du PACE chez B. subtilis
Le second axe aura pour objectif de démontrer la robustesse et la polyvalence du système à travers plusieurs expériences d'évolution indépendantes. Celles-ci porteront sur l'évolution d'interactions protéine-ADN, protéine-protéine et protéine-molécule. En particulier, l'évolution du facteur D vers d'autres promoteurs ou insensible à son antisigma FlgM, ainsi que la modification du système senseur LytST afin de reconnaître de nouvelles molécules, permettront de tester la capacité du PACE à générer de nouveaux modules de régulation et de détection.
À terme, ce travail vise à établir un nouveau cadre d'évolution dirigée continue chez B. subtilis, ouvrant la voie à l'ingénierie de fonctions biologiques complexes et à la création de systèmes de régulation orthogonaux répondant à des signaux environnementaux spécifiques.

Le système PACE a été développé chez Escherichia coli avec un phage très particulier : M13. De ce fait les évolutions ne peuvent être faite que dans un seul contexte cellulaire. Nous voulons développer ce système dans une autre bactérie avec un phage lytique phages qui sont très majoritaire chez toutes les espèces bactériennes. Cette preuve de principe pourrait ouvrir la possibilité de développer le PACE dans beaucoup d'organisme.

L'objectif général de cette thèse est d'optimiser le système de PACE chez B. subtilis. deux axes sont proposés ayant pour objectif pour l'un de le rendre plus rapide et plus stringent, et pour l'autre de l'adapter à différents types de fonctions biologiques.

les méthodes développées dans ce sujet sont :
des constructions de phage et de souches (développé dans notre équipe collaboration P. Tavares)
des méthodes classique de propagation de phage lytique
des méthodes de cultures continues (développées dans notre équipe collaboration C. Guerin)
des méthodes de séquençage (ONT, bar-codage)
et des méthodes d'analyse de données de séquençage (collaboration P. Nicolas).