Thèse Biologie Redox du Mitoribosome chez la Levure de Fission Schizosaccharomyces Pombe H/F

Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health

Établissement : Université Paris-Saclay GS Life Sciences and Health
École doctorale : Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
Laboratoire de recherche : I2BC - Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
Direction de la thèse : Nathalie BONNEFOY ORCID 0000000250688849
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-03-23T23:59:59

Les mitochondries sont des organites contenant leur propre génome (ADNmt) et machinerie de traduction, synthétisant plusieurs sous-unités des complexes de la phosphorylation oxydative (OXPHOS), qui assurent la production d'énergie indispensable à la cellule. Des défauts de structure ou d'assemblage de la chaîne OXPHOS sont ainsi responsables de pathologies graves, généralement incurables. Mieux connaitre les étapes de l'expression des gènes mitochondriaux, leur régulation, et la formation de la chaîne OXPHOS permet donc de mieux comprendre les causes de maladies mitochondriales et rechercher des traitements. Pour cela, les levures sont d'excellents modèles des cellules humaines, car l'ensemble de ces processus sont en général très bien conservés et les mutants respiratoires faciles à étudier. En particulier, la levure de fission Schizosaccharomyces pombe présente de nombreuses caractéristiques très semblables aux cellules humaines en ce qui concerne la physiologie mitochondriale, la structure du génome et l'expression des gènes dans la mitochondrie [1].

Comme les complexes OXPHOS, le ribosome mitochondrial possède une origine génétique double : les ARNs sont codés par l'ADNmt, et les protéines par l'ADN nucléaire. De manière intéressante, des centres Fer-Soufre (Fe-S) ont récemment été détectés dans les deux sous-unités du ribosome mitochondrial grâce à l'optimisation de la résolution des analyses en cryo-microscopie électronique (cryo-EM) [2,3]. Il a aussi été montré qu'un centre Fe-S joue un rôle de cofacteur architectural et/ou capteur de l'état redox pour le facteur d'assemblage du mitoribosome humain METTL17, ainsi que pour son homologue chez S. cerevisiae Rsm22 [4,5]. Ces observations soulignent l'existence d'un lien étroit entre deux fonctions mitochondriales essentielles : la traduction et la biogenèse des centres Fe-S.

Chez S. pombe, Rsm22 présente toutes les caractéristiques de cette famille de protéines, notamment la conservation des cystéines capables de coordonner le centre Fe-S dans la protéine METTL17 ainsi qu'un tripeptide LYR qui pourrait être impliqué dans l'insertion du centre Fe-S comme cela a été démontré pour d'autres protéines Fe-S mitochondriales (6]. Rsm22 de S. pombe se distingue cependant par deux particularités : (i) elle est produite sous forme d'une protéine hybride avec la chaperonne à cuivre Cox11 [7], et (ii) le gène codant cette fusion est dupliqué. Une autre protéine fusion, Aco-L21, associe de manière permanente la protéine de la grande sous-unité du mitoribosome L21 et une protéine de type aconitase [8], une enzyme classique du cycle de Krebs possédant un centre Fe-S [9]. Ces observations suggèrent que des interactions entre centres Fe-S et mitoribosome existent aussi chez S. pombe et que les protéines de fusion pourraient jouer un rôle clé dans ces interactions.

Le projet de thèse va explorer la biologie redox du mitoribosome de S. pombe en analysant comment Rsm22-Cox11 et Aco-L21 pourraient moduler la traduction mitochondriale en intégrant des signaux redox par leurs centres Fe-S. En parallèle, ce travail permettra de mieux comprendre l'intérêt fonctionnel des protéines de fusion dans ces régulations. En effet, au moins deux autres protéines de fusion relient également biologie redox et mitoribosome, suggérant que ce type particulier de structure protéique pourrait optimiser le couplage de ces deux processus. Pour cela, nous collaborerons à l'ICSN avec M.-P. Golinelli et C. Vallières, qui sont des expertes des protéines Fe-S [10]. De plus, l'immunoprécipitation du mitoribosome de S. pombe sera réalisée à l'aide de trois types de protéines étiquetées différentes : Rsm22 comme facteur d'assemblage, bL21 comme protéine du mitoribosome, et Mrh5 comme facteur de traduction [11]. Cette approche permettra de générer des échantillons purifiés de mitoribosome dans différents états d'assemblage, qui pourront ensuite être analyses en cryo-EM par l'équipe de J. Rorbach en Suède [2].

Depuis la découverte des ribosomes sous la forme des granules de Palade il y a 70 ans, les nombreuses recherches menées sur leur structure et fonctionnement ont montré qu'il s'agit de machines moléculaires extrêmement sophistiquées. Les ribosomes mitochondriaux ne font pas exception, mais se distinguent par une double origine génétique, nucléaire et mitochondriale, et par leur capacité de spécialisation traductionnelle, ce qui leur confère également un rôle régulateur [11]. De plus, chez l'homme, des liens forts ont été très récemment établis entre les centres Fer-Soufre (Fe-S), synthétisés dans la mitochondrie, et le ribosome mitochondrial, que ce soit en termes d'assemblage via la protéine Fe-S METTL17 [4,5] ou de structure par la présence de centres Fe-S directement au sein du mitoribosome [2,3]. Les centres Fe-S sont des groupements métalliques inorganiques qui peuvent jouer des rôles catalytiques ou régulateurs, comme celui de senseurs redox. Leur interaction avec le mitoribosome pourrait permettre à ces ribosomes de ressentir l'état redox de leur environnement afin potentiellement d'adapter leur biogenèse et/ou leur activité aux besoins de la cellule ou aux cofacteurs métalliques disponibles pour les protéines qu'ils synthétisent.

La levure S. pombe est un excellent modèle des cellules humaines pour les études sur la mitochondrie, de par sa similarité avec les cellules humaines [1] et la facilité d'étude des mutants mitochondriaux. De manière intéressante, chez S. pombe, au moins 10 protéines fusionnées mitochondriales sont présentes [1] et plusieurs d'entre elles font intervenir des protéines redox et/ou impliquées dans la traduction mitochondriale. Parmi celles-ci, on trouve plusieurs protéines en lien avec le mitoribosome, dont Rsm22-Cox11 et Aco2-L21. Rsm22 est prédite pour être comme son homologue humain METTL17 un facteur d'assemblage du mitoribosome de S. pombe. Cox11 serait une chaperonne à cuivre importante pour l'assemblage du complexe IV. Aco2 code pour une aconitase, protéine Fe-S et enzyme clé du cycle de Krebs. L21 est une protéine ribosomale de la grande sous-unité universellement conservée, avec des équivalents chez les bactéries, dans le cytosol et la mitochondrie des eucaryotes.

Le projet de thèse proposé vise à étudier l'implication possible de Rsm22-Cox11 et Aco2-L21 dans la biologie redox du mitoribosome chez S. pombe, et à explorer si les fusions de protéines pourraient présenter des avantages pour médier ces régulations.

Nous souhaitons explorer plusieurs aspects de la biologie redox des mitoribosomes en développant trois axes de travail :

(1) Etudier la protéine Rsm22 de S. pombe, homologue de la protéine humaine METTL17, prédite pour être un facteur d'assemblage du mitoribosome. Cela comprend d'abord l'évaluation du rôle des centres Fe-S dans la modulation de la biogenèse du mitoribosome. Puis la détermination de l'éventuelle contribution de sa fusion avec la chaperonne à cuivre Cox11 à l'intégration de divers signaux redox.

(2) Analyser la protéine Aco-L21 pour comprendre si cette fusion entre une aconitase et une protéine faisant partie du mitoribosome peut représenter un deuxième niveau d'intégration des signaux redox, permettant une régulation de la traduction mitochondriale et sa spécialisation.

(3) Utiliser différentes souches exprimant des versions étiquetées de protéines associées au mitoribosome, afin de réaliser l'immunoprécipitation de monosomes mitochondriaux, pour obtenir des échantillons à analyser en cryo-EM. Ces analyses permettront de visualiser d'éventuels nouveaux centres Fe-S tout en en générant la première structure de mitoribosome de S. pombe.

Pour l'ensemble de ce projet, nous disposons de résultats préliminaires et de nombreux outils et nous recevrons le soutien de collaborateurs biochimistes experts des protéines Fe-S, et de spécialistes mondiaux des structures de mitoribosomes. Ainsi nous pensons lever une partie du voile sur les interactions complexes entre les centres Fe-S et la biologie du ribosome mitochondrial chez la levure de fission.

Les travaux requerront l'utilisation de diverses techniques et impliqueront des plateformes, notamment celle de spectrométrie de masse, et des collaborations avec d'autres laboratoires.

1. L'étude des gènes fusionnés codant Rsm22-Cox11 et Aco-L21 impliquera de nombreuses constructions de souches, délétées, étiquetées ou mutées, qui feront appel aux techniques classiques de PCR, mutagenèse dirigée ou au hasard, transformation de levure, recombinaison homologue, échange de plasmides dans la levure.

2. L'effet des mutations sur la traduction mitochondriale et le fonctionnement de la chaîne OXPHOS fera appel à tout l'éventail de techniques biochimiques et moléculaires d'analyse de l'expression des gènes mitochondriaux et de l'assemblage des complexes respiratoires dont Northern blot, marquage radioactif des protéines néo-synthétisées, préparation de mitochondries purifiées, western blot, gels en bleu natifs, spectres de cytochromes, cytométrie en flux couplée à des sondes pour mesurer les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et l'accumulation de fer, le tout en conditions normales ou après un stress oxydant ou réducteur.

3. Les analyses biochimiques des centres Fe-S nécessiteront l'expression et la purification de protéines chez E. coli, dans une boîte à gant pour être sous atmosphère non oxydante. Ces protéines seront ensuite analysées par différentes techniques incluant spectroscopie UV-Visible, dichroïsme circulaire, et dosage du fer et du soufre et en testant différentes conditions redox pour évaluer leur impact sur la stabilité et la fonctionnalité des centres Fe-S. Ces expériences seront réalisées dans les locaux de nos collaboratrices à l'ICSN.

4. Les techniques d'immunoprécipitation seront mises en oeuvre pour obtenir en un minimum d'étapes des fractions purifiées du mitoribosome de S. pombe. Ces échantillons seront, d'une part, analysés par spectrométrie de masse via la plateforme I2BC dédiée (SICaPS) dont nous avons l'habitude d'utiliser les services, et d'autre part, envoyés à nos collaborateurs en Suède, spécialistes mondiaux de la structure des mitoribosomes, qui en réaliseront la structure par cryo-EM.

L'ensemble de ces techniques très variées offrira à l'étudiant une formation très large et très solide en génétique, biologie moléculaire et biochimie ainsi que des bases de bio-informatique, et biophysique, voire biologie structurale ; le tout avec le soutien et encadrement de deux équipes voisines chacune experte dans son domaine, ainsi que des interactions avec des collaborateurs internationaux.