Thèse les Transporteurs Mmpl Organisation au Sein de l'Enveloppe Mycobactérienne et Couplage Fonctionnel avec la Machinerie de Biosynthèse des Lipides H/F

Université de Toulouse

Établissement : Université de Toulouse
École doctorale : BSB - Biologie, Santé, Biotechnologies
Laboratoire de recherche : IPBS - Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale
Direction de la thèse : Christian CHALUT ORCID 0000000248491369
Début de la thèse : 2026-10-01
Date limite de candidature : 2026-04-30T23:59:59

Résumé

Les mycobactéries regroupent plusieurs pathogènes importants tels que Mycobacterium tuberculosis, l'agent de la tuberculose. Ces bactéries possèdent une enveloppe atypique caractérisée par la présence d'une membrane externe, appelée mycomembrane, constituée d'acides gras à très longues chaînes, les acides mycoliques, associés à divers lipides complexes. Ces composés jouent un rôle déterminant dans la virulence des mycobactéries et leur résistance intrinsèque à de nombreux antibiotiques. Les mécanismes assurant le transport de ces lipides depuis le compartiment cytoplasmique où ils sont synthétisés, vers la mycomembrane, restent mal compris. Une famille de transporteurs appelés MmpL (Mycobacterial membrane protein Large) joue un rôle central dans ce processus. Ces transporteurs se répartissent en deux groupes selon la présence (groupe I) ou l'absence (groupe II) d'un domaine coiled-coil localisé dans leur région périplasmique. Le groupe II comprend les MmpL dédiés à l'export des acides mycoliques tandis que le groupe I regroupe ceux impliqués dans le transport des autres familles de lipides de la membrane externe.

Par modélisation, nous avons récemment montré que les MmpL du groupe I s'assemblent en trimères via leur domaine coiled-coil périplasmique, conduisant à la formation d'un tunnel hydrophobe traversant la paroi cellulaire. Sur cette base, nous proposons un modèle de transport dans lequel les lipides, après leur synthèse dans le cytoplasme, sont transférés aux trimères de MmpL pour être transloqués à travers la membrane plasmique puis acheminés vers la membrane externe via la structure tubulaire formée lors de leur oligomérisation. Ce modèle reste toutefois à valider expérimentalement. L'organisation des MmpL du groupe II au sein de l'enveloppe demeure, quant à elle, inconnue. L'absence de domaine coiled-coil périplasmique ouvre la possibilité qu'une ou plusieurs protéines périplasmiques s'associent in vivo à ces transporteurs pour médier leur oligomérisation. Par ailleurs, il a été proposé que les transporteurs MmpL forment des complexes avec les enzymes impliquées dans la biosynthèse des lipides pour optimiser le transport mais, à ce jour, cette hypothèse n'a pas été démontrée expérimentalement.

Ce projet vise à répondre à ces questions en se focalisant sur l'étude de deux transporteurs MmpL chez la mycobactérie modèle M. smegmatis : MmpL10 (groupe I), impliqué dans le transport des polyphléates de tréhalose, et MmpL3 (groupe II), responsable de l'export des acides mycoliques. Nous mettrons en oeuvre une combinaison d'approches génétiques et biochimiques pour déterminer l'organisation structurale ces transporteurs au sein de l'enveloppe et caractériser leurs interactions fonctionnelles avec la machinerie de biosynthèse des lipides. Les connaissances acquises pourront être étendues à l'export des lipides d'enveloppe chez d'autres mycobactéries, notamment M. tuberculosis, et chez des genres apparentés présentant une organisation d'enveloppe similaire. Par ailleurs une meilleure compréhension de l'organisation et du mode d'action des MmpL pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques en ciblant l'export des lipides de la mycomembrane, une structure jouant un rôle clé de la pathogénicité mycobactérienne.

Les mycobactéries regroupent divers pathogènes stricts tels que Mycobacterium tuberculosis, l'agent de la tuberculose, ou opportunistes, responsables d'infections chez des personnes fragilisées. Les traitements de ces infections restent complexes en raison de la résistance intrinsèque de ces bactéries aux antibiotiques. Les mycobactéries possèdent une enveloppe cellulaire atypique extrêmement riche en lipides. Cette structure comporte une membrane externe, appelée mycomembrane, constituée d'acides gras à très longues chaînes, les acides mycoliques, et de diverses familles de lipides complexes (1). Ces lipides jouent un rôle clé dans les interactions hôte-pathogène et la perméabilité de l'enveloppe, contribuant substantiellement à la résistance des mycobactéries aux antibiotiques (2). De façon notable, la mycomembrane est la cible de plusieurs antituberculeux majeurs et représente une cible attractive pour le développement de nouveaux composés thérapeutiques. Approfondir notre compréhension de l'organisation et de la biogenèse de la mycomembrane est essentiel pour mieux appréhender la physiopathologie des infections mycobactériennes et orienter le développement de traitements innovants.

Les voies de biosynthèse des lipides de la mycomembrane sont bien caractérisées mais les mécanismes impliqués dans leur transfert depuis le compartiment cytoplasmique où ils sont synthétisés, vers la surface de l'enveloppe, restent mal compris. Une famille de transporteurs appelés MmpL (Mycobacterial membrane protein Large) joue un rôle central dans ce processus (3, 4). Ces transporteurs, constitués de 12 hélices transmembranaires et deux boucles périplasmiques, se répartissent en deux groupes selon la présence (groupe I) ou de l'absence (groupe II) d'un domaine coiled-coil supplémentaire dans la boucle 2 périplasmique. Le groupe II inclut les transporteurs dédiés à l'export des acides mycoliques (MmpL3 et MmpL11) tandis que le groupe I regroupe les transporteurs impliqués dans le transport des autres lipides de la membrane externe (5, 6).

La structure des MmpL, ainsi que leur organisation au sein de l'enveloppe et leur rôle précis dans le transport des lipides restent très mal caractérisés. Récemment, plusieurs laboratoires, dont le nôtre, ont proposé que les MmpL du groupe I s'assemblent sous forme de trimères via leur domaine coiled-coil périplasmique, conduisant à la formation d'un tunnel hydrophobe traversant la paroi cellulaire (6, 7). Ces observations soutiennent un modèle de transport dans lequel les lipides, une fois synthétisés dans le cytoplasme, sont transférés aux trimères de MmpL, transloqués à travers la membrane plasmique, puis acheminés vers la membrane externe via la structure tubulaire formée lors de leur oligomérisation. Ce modèle reste cependant à valider, l'état oligomérique des MmpL n'ayant jamais été étudié dans le contexte natif de l'enveloppe mycobactérienne. Par ailleurs, l'organisation au sein de l'enveloppe des MmpL du groupe II dédiés au transport des acides mycoliques demeure inconnue. L'absence de domaine coiled-coil périplasmique chez ces transporteurs suggère une organisation monomérique, en accord avec des données cristallographiques (8). Toutefois, il est possible qu'une ou plusieurs protéines périplasmiques s'associent in vivo à ces transporteurs pour médier leur oligomérisation et former, en trans, une structure tubulaire analogue à celle observée pour les MmpL du groupe I. Enfin, il a été proposé que les transporteurs MmpL forment des complexes avec les enzymes impliquées dans la biosynthèse des lipides afin d'optimiser l'efficacité du transport mais actuellement aucune donnée expérimentale ne vient étayer cette hypothèse. Par conséquent, de nombreuses questions restent en suspens concernant le transport des lipides d'enveloppe médié par les MmpL.

Ce projet a pour objectif de répondre à certaines des interrogations sur le transport des lipides d'enveloppe médié par les MmpL en apportant des informations sur l'organisation de ces transporteurs au sein de l'enveloppe mycobactérienne (objectif 1) et sur le couplage fonctionnel entre les machineries de biosynthèse et de transport des lipides (objectif 2). Pour aborder ces questions, nous nous focaliserons sur l'étude de deux transporteurs représentatifs de chacune des classes de MmpL chez la mycobactérie modèle Mycobacterium smegmatis (Msm). Pour les MmpL du groupe I, nous utiliserons comme modèle le transporteur MmpL10, impliqué dans l'export des polyphléates de tréhalose (TPP), une famille de lipides de la mycomembrane dont nous avons récemment caractérisé la voie de biosynthèse au laboratoire (9, 10). Pour l'étude des MmpL du groupe II, nous prendrons comme modèle le transporteur MmpL3, responsable du transport des acides mycoliques sous forme de tréhalose monomycolates (TMM) vers la mycomembrane (11).

Les objectifs du projet visent plus précisément :
1) A déterminer l'état oligomérique de ces deux transporteurs au sein de l'enveloppe et le cas échéant, à identifier les déterminants structuraux et/ou les facteurs protéiques impliqués dans l'oligomérisation.
2) A établir les liens fonctionnels existant entre la machinerie de biosynthèse des TPP et TMM et ces MmpL au niveau cytoplasmique et périplasmique.

Objectif 1. Organisation des transporteurs MmpL au sein de l'enveloppe mycobactérienne.

Dans un premier temps nous examinerons l'état oligomérique des transporteurs MmpL3 et MmpL10 dans l'enveloppe mycobactérienne de Msm en utilisant un système double-hybride bactérien basé sur la reconstitution de l'activité de la DHFR murine (mDHFR) et la capacité des bactéries à croître en présence de triméthoprime (12). Par ailleurs, le domaine coiled-coil de MmpL10 sera exprimé dans une souche sauvage de Msm, en fusion avec une séquence signal clivable permettant son adressage dans le périplasme, pour voir s'il induit une diminution, voire une inhibition, de la production des TPP dans la bactérie en perturbant l'oligomérisation du transporteur. Alternativement ou en complément, nous utiliserons le système double-hybride BACTH, basé sur la reconstitution d'une adénylate cyclase chez E. coli (13) pour étudier l'oligomérisation de ces MmpL après production chez ce microorganisme.

Si une oligomérisation des transporteurs est observée, nous chercherons dans un second temps à identifier les déterminants protéiques impliqués dans ce processus. Pour MmpL10 (groupe I), nous évaluerons le rôle du domaine coiled-coil en examinant l'impact de la délétion de ce domaine sur l'oligomérisation du transporteur à l'aide du système double-hybride mDHFR chez Msm. Nous analyserons également l'effet de la co-expression du domaine coiled-coil isolé sur l'oligomérisation du transporteur MmpL10 natif dans ce système. Enfin, nous construirons des variants chimériques de MmpL10 comportant le domaine coiled-coil d'autres MmpL du groupe I pour déterminer la spécificité de ce domaine dans l'interaction protéique et le transport des lipides dans un contexte cellulaire. Par ailleurs, nous avons récemment montré qu'une autre famille de protéines membranaires dénommées GapL module le transport des lipides médié par les MmpL du groupe I (données non publiées). Dans le contexte de la production des TPP, nous chercherons à déterminer si cette modulation est liée à une modification de l'état oligomérique de MmpL10 en analysant son niveau d'oligomérisation dans une souche mutante de Msm déficiente pour les protéines GapL à l'aide du système double-hybride mDHFR. Pour le transporteur MmpL3 (groupe II), qui ne possède pas de domaine coiled-coil périplasmique, nous rechercherons si d'éventuelles protéines périplasmiques sont susceptibles de s'associer au transporteur in vivo pour médier son oligomérisation. Pour ce faire, des variants de MmpL3 portant des mutations ponctuelles dans sa région périplasmique, entraînant un fort ralentissement de la croissance bactérienne, seront produits dans une souche de Msm déficiente en MmpL3 natif (14). Ces souches seront cultivées et repiquées de manière itérative pour sélectionner des mutants présentant une croissance restaurée. L'ADN génomique de ces mutants sera ensuite séquencé pour identifier les mutations suppressives et caractériser les protéines potentiellement partenaires du transporteur.

Objectif 2. Couplage fonctionnel entre la machinerie de biosynthèse des lipides et les MmpL

La synthèse des TPP débute dans le compartiment cytoplasmique par la production d'un précurseur, un diacyltrehalose (DAT), impliquant l'action de plusieurs enzymes (9). Ce précurseur est ensuite transféré à travers l'enveloppe par MmpL10, puis pris en charge au niveau de la membrane externe par une acyltransférase (PE), qui catalyse la formation des TPP à partir de plusieurs molécules de DAT (10). De manière analogue, l'incorporation des acides mycoliques dans la mycomembrane passe par la synthèse cytoplasmique de tréhalose monomycolates (TMM). Après leur export par MmpL3, les TMM sont convertis en tréhalose dimycolates (TDM), constituants majeurs de l'enveloppe mycobactérienne, par un ensemble d'acyltransférases formant un complexe appelé Ag85 (15). Par conséquent, un couplage fonctionnel entre les enzymes de biosynthèse et les transporteurs MmpL pourrait intervenir à la fois au niveau cytoplasmique et périplasmique.

Dans un premier temps nous examinerons le couplage entre les transporteurs MmpL et la machinerie de biosynthèse au niveau cytoplasmique. Nous utiliserons le système double-hybride bactérien mDHFR pour mettre en évidence les interactions entre MmpL10 et les enzymes de biosynthèse du DAT, d'une part, et entre MmpL3 et les enzymes de biosynthèse des TMM, d'autre part, directement chez Msm. Ces interactions seront confirmées in vitro par une approche « pull-down ». Par ailleurs, nous déterminerons si l'oligomérisation des transporteurs a une incidence sur les interactions avec les protéines de biosynthèse. Dans le cadre de la production des TPP, s'il s'avère que le domaine coiled-coil du transporteur MmpL10 est impliqué dans son oligomérisation, nous évalueront les interactions entre les protéines de biosynthèse et une version MmpL10 dépourvue de domaine coiled-coil dans le système double-hybride mDHFR.

Dans un second temps, nous examinerons le couplage entre les transporteurs MmpL et la machinerie de biosynthèse au niveau périplasmique. En particulier, nous déterminerons si la région apicale du domaine coiled-coil de MmpL10 interagit avec l'acyltransférase PE impliquée dans l'étape finale de la formation des TPP. Pour cela, MmpL10 sera produit avec un acide aminé photoréactif (pBPA) incorporé dans la région apicale du domaine coiled-coil grâce à un système orthogonal tRNA / aminoacyl-tRNA synthétase (16), dans une souche de Msm exprimant la protéine PE fusionnée à une étiquette Flag. Après irradiation UV des bactéries, les protéines cellulaires seront extraites puis analysées par Western blot pour détecter une éventuelle interaction entre les deux partenaires. Des protéines chimères de MmpL10, dans lesquelles le domaine coiled-coil natif sera remplacé par celui d'autres transporteurs MmpL, seront également produites dans cette souche afin d'évaluer la spécificité de l'interaction observée. Par ailleurs, si nous identifions des protéines périplasmiques impliquées dans l'oligomérisation de MmpL3 (objectif 1), nous mettrons en oeuvre une approche similaire pour analyser d'éventuelles interactions entre ces protéines et les acyltransférases du complexe Ag85.