Thèse Développement d'Un Test de Détection Spécifique de Biomarqueurs de Mycobacterium Tuberculosis à l'Aide de Nanobodies pour le Diagnostic de la Tuberculose H/F

Doctorat.Gouv.Fr

Description du programme de recherche :
Le projet vise dans un premier temps à développer un outil de détection spécifique et sensible ciblant des biomarqueurs de la mycobactérie M. tuberculosis, les protéines du complexe Ag85 (A,B et C). Dans un deuxième temps, ces résultats serviront à mettre au point un test de diagnostic de type POC (Point of Care). Deux éléments principaux constituent le test : la détection du biomarqueur (Etape 1) et la conversion de la détection en un signal mesurable (Etape 2).

La détection du biomarqueur (Etape 1) sera réalisée par interaction avec un nanobody.
Dans ce contexte, après immunisations de lamas plusieurs nanobodies ont déjà été obtenus au sein du laboratoire contre les protéines Ag85A et Ag85B qui sont connus pour être de puissants antigènes mycobactériens. Le même protocole sera appliqué pour générer des nanobodies contre l'Ag85C.
Leurs propriétés d'interaction seront déterminées par des techniques biophysiques pour déterminer les constantes d'affinité ainsi que la réactivité croisée des nanobodies avec les 3 antigènes étudiés Ag85A, Ag85B et Ag85C de M. tuberculosis et des autres mycobactéries (en particulier M. abscessus) sont actuellement en cours de caractérisation in vitro et in vivo.

La validation in vivo des nanobodies sera réalisée avec des cultures de mycobactéries, des mélanges de bactéries et des échantillons biologiques présentant les biomarqueurs sécrétés ou présents à la surface de bactéries. Cette validation consistera, entre autre, à définir le seuil de détection ainsi que la spécificité des biomarqueurs. Des marquages fluorescents de ces nanobodies pourront être réalisés par bio-ingénierie et faciliteront la détection visuelle des mycobactéries.
La mise au point d'un diagnostic nécessite la conversion de l'interaction biomarqueur-Nanobody en un signal mesurable et analysable au format Point of Care (Etape 2). Ceci peut être réalisé par immunochromatographie (bandelette) ou via l'utilisation d'un dispositif électrochimique de microfluidique. Ces deux approches seront menées en parallèle, soit au laboratoire, soit en collaboration avec la société Alterdiag.
L'objectif final sera le développement d'un test par immuno-chromatographie rapide et fiable et qui sera réalisé selon des méthodes déjà décrites et qui seront mises en place au laboratoire en collaboration étroite avec la société AlterDiag. La tuberculose est une maladie infectieuse qui pose un important problème de santé publique à l'échelle mondiale, avec une estimation par l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé) d'environ 10 millions de nouveaux cas et plus d'un million de morts par an. De plus, un quart de la population mondiale est infectée par le complexe Mycobacterium tuberculosis (MTBC). Dans ce contexte, le développement de nouveaux tests de diagnostic, répondant à divers critères (résultat rapide, fiabilité, spécificité, faible couteux, mise en place facile) (Hong et al, 2022) est de première importance dans des pays disposant de peu d'infrastructure et de peu de personnel médical.
L'équipe d'accueil LBP possède une expertise importante sur la biologie des mycobactéries (notamment M. tuberculosis et M. abscessus), et en particulier sur le rôle des lipides et des enzymes impliquées dans leur métabolisme, la résistance aux antibiotiques, et travaille aussi au développement d'outils de diagnostic (Le Moigne et al 2022, Viljoen et al 2028). Elle a établi de nombreuses collaborations avec des laboratoires hospitaliers, ce qui permet l'accès aux échantillons biologiques. Les nanobodies (dérivés d'anticorps) sont maintenant largement utilisés pour le diagnostic (Jin et al 2023). Cette technologie a été mise en place au sein du laboratoire et sera utilisée au cours de ce projet pour la détection spécifique des mycobactéries. Le projet proposé vise à développer un outil de détection spécifique et sensible ciblant des biomarqueurs protéiques de la mycobactérie M. tuberculosis. Des résultats seront ensuite utilisés pour la mise au point d'un test de diagnostic de type POC (Point of Care). Le projet repose sur la détection de protéines 'biomarqueurs' cibles issues de mycobactéries (Bekmurzayeva et al 2013, Phunpae et al 2024). La reconnaissance spécifique sera réalisée à l'aide de nanobodies (fragments d'anticorps). Ceux ci seront générés en utilisant un protocole établi d'immunisation-sélection par phage display-screen ELISA. Les nanobodies seront produits de manière recombinante et la caractérisation des interactions Antigen-Nanobody par des mesures biophysiques (par BLI, Biolayer Interferometry). La détection des biomarqueurs à la surface des bactéries sera réalisée par microscopie de fluorescence ou cytométrie de flux. L'évaluation de la sensibilité de la reconnaissance des biomarqueurs par les nanobodies dans les cultures ou dans des échantillons de fluides de patients infectés) sera effectuée par différentes techniques permettant la détection de l'interaction. Dans un deuxième temps, la mesure du signal résultant de l'interaction biomarqueur-Nanobody sera réalisée par immunochromatographie avec la mise au point du test sur bandelette.